МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
НАКАЗ
13.03.2010 N 226
Про затвердження методичних
рекомендацій "Санітарно-мікологічні
дослідження питної води"
Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідеміологічного благополуччя населення" ( 4004-12 ), з метою науково-методичного забезпечення державного санітарно-епідеміологічного нагляду наказую:
1. Затвердити методичні рекомендації "Санітарно-мікологічні дослідження питної води", що додаються.
2. Департаменту організації санітарно-епідеміологічного нагляду методичні рекомендації "Санітарно-мікологічні дослідження питної води" довести до відома керівників установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби, зацікавлених міністерств, інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку.
3. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту організації санітарно-епідеміологічного нагляду Мухарську Л.М.
Перший заступник Міністра - головний
державний санітарний лікар України О.М.Біловол
Затверджено
Наказ Міністерства охорони
здоров'я України
13.03.2010 N 226
Методичні рекомендації
"Санітарно-мікологічні
дослідження питної води"
1. Загальні положення
1.1. В останні роки значно зростає роль мікроскопічних грибів (мікроміцетів) у виникненні патологічних процесів у людини (алергічні захворювання, мікози легенів, шкіри, печінки, шлунково-кишкового тракту і ін.). Під непомірним тиском пестицидів, фармакологічних препаратів порушилась певна рівновага у світі мікроорганізмів й у нішах, займаних ними, почали домінувати гриби, які завдяки генетично-обумовленим властивостям, мають високий рівень виживання в нових умовах. Здатність мікроміцетів функціонувати в екстремальних умовах підтверджено їх домінуванням в мікробіоценозі Чорнобильської зони. Відмічається також агресивність тих видів мікроміцетів, які раніше не проявляли патогенних властивостей або проявляли їх лише за певних умов.
1.2. Одним із шляхів потрапляння мікроміцетів в організм людини є надходження з питною водою. Наслідки змін мікробіологічної характеристики питної води при забрудненні джерел водопостачання при екологічних катастрофах (внаслідок затоплення поселень чи ін.) непередбачувані.
1.3. Метод визначення мікроміцетів в питній воді ґрунтується на виявленні та ідентифікації найбільш небезпечних для здоров'я людини грибів - Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillium chrysogenum, Penicillium expansum, Cladosporium cladosporioides, Alternaria alternate.
2. Диференціація мікроскопічних
грибів за морфологічними ознаками
2.1. Candida albicans. На середовищі Сабуро колонії молочно-кремові, блискучі, віскоподібні, за звичай гладкі. Під мікроскопом - клітини поодинокі, активно почкуються. Оптимальна температура - 27 град.С.
2.2. Aspergillus fumigatus. Колонії на середовищі Сабуро швидкоростучі, розгалужені, повстяні або пухнасті, спочатку білі, по мірі спороутворення стають сіроблактино-зеленими або навіть темно-оливково-сірими. Під мікроскопом конідіальні головки колонкоподібні 50-400 мкм. Конідієносці відходять прямо від гіф у вигляді коротких гілок 500 х 5-8 мкм, звичайно розширюються до верхівки. Конідії кулеподібні, 2,5-3 мкм, у масі темно-зелені, гладкі або шорсткі. Оптимальна температура - 27 град.С.
2.3. Aspergillus niger. Колонії ростуть швидко до великих розмірів, рідко обмежені в діаметрі до 2,5-5 см, високі, до 3 мм висотою, гладкі або пухнасті, рівні. Субстратний міцелій білий або світло-жовтий, занурений або стелиться по поверхні середовища. Під мікроскопом конідіальні головки чорні, іноді тьмяно коричнево-чорні, як правило, сконцентровані, спочатку кулеподібні, потім радіальні, які потім розпадаються на декілька рихлих але чітких колонок 700-800 мкм в діаметрі. Конідієносці 1-3 мм в висоту, 15-20 мкм в ширину, з гладкою оболонкою 2-2,5 мкм товщиною. Конідії кулеподібні, іноді дископодібні, 4-5 мкм в діаметрі, з добре помітною оболонкою, шорсткі або сильно шипуваті з чіткими смугами пігменту. Оптимальна температура 30 град.С.
2.4. Aspergillus flavus. Колонії можуть рости швидко або повільно, широкорозгалужені, рівні, плоскі іноді радіально-бороздчасті або складчасті, забарвлені від жовтого до зеленого. Під мікроскопом конідіальні головки змінюють забарвлення від яскравих до темно-зелених відтінків і мають 300-600 мкм в діаметрі, розділяються на декілька колонок. Конідієносці безбарвні, 1-2,5 мм в висоту. Конідії кулеподібні або близької форми, 3-6 мкм в діаметрі, іноді еліптичні 4-5 х 3,5-4,5 мкм, нечітко шорсткі. Оптимальна температура 32 град.С.
2.5. Penicillium chrysogenum. Колонії швидко ростуть до великих розмірів, бархатисті або низькоповстяні, радіально-бороздчасті з краєм росту 1-2 мм в ширину. Міцелій жовто-кремовий, конідіальна зона жовто-зелена, синьо-сіро-зелена або інших подібних відтінків. Під мікроскопом конідієносці 150-350 х 3-3,5 мкм, гладенькі, незабарвлені, асиметричні, конідіальні ланцюжки до 200 мкм довжини. Конідії еліптичні, 2-2,5 х 1,5-2 мкм, з гладкою оболонкою, у масі ніжнозеленуваті. Оптимальна температура 26 град.С.
2.6. Penicillium expansum. Колонії швидкоростучі, жовто-зелені, сіро-зелені з жовтуватим відтінком, радіально-бороздчаті з зачатковими кореміями, що роблять колонії мучнистими або зернистими на вигляд. Під мікроскопом конідієносці поодинокі або скупчені, які відходять від субстратних гіф, 150-700 х 3-3,5 мкм, гладкі або дрібношорсткі. Конідії 3-3,5 мкм в діаметрі, в масі темно-жовто-зелені в довгих переплетених ланцюжках, 150-200 мкм. Конідії еліптичні, 3-3,5 мкм в діаметрі, гладкі, в масі темно-жовто-зелені, у довгих переплетених ланцюгах, 150-200 мкм. Оптимальна температура росту 28 град.С.
2.7. Cladosporium cladosporioides. Колонії з обмеженим ростом, 2-4 см в діаметрі, повстяні, іноді пухнасті в центрі, а по краям шерстисті, або майже бархатисті, нерівні, складчасті, оливково-зелені або оливково-коричневі. Під мікроскопом конідієносці до 350 х 2,6 мкм, іноді слабо виражені, розгалужені, світло-оливкові, світло-коричневі або коричневі з гладкою або дрібнобугорчастою оболонкою. Конідії в довгих ланцюгах, часто одноклітинні 3-11 х 2-5 мкм, еліптичні або подібні до лимону. Оптимальна температура росту 25 град.С.
2.8. Alternaria alternata. На середовищі Сабуро колонії чорні, іноді сіро-оливкові або брудно-сірі, більш-менш пухнасті, широко- та швидкоростучі. Конідієносці поодинокі чи в невеликих групах, прості, рідко розгалужені, блідо-оливкові чи золотисто-коричневі, 50 х 3-6 мкм, з гладкою оболонкою. Конідії утворюються в довгих, часто гіллястих ланцюгах, булавоподібні, грушовидні, яйцевидні чи еліптичні, часто з короткою конічною або циліндричною шийкою до 1/3 довжини конідії, блідо- або золотисто-коричневі, з 3-8 поперечними перегородками і декількома подовжніми косими (20) 37 (63) х (9) 13 (18) мкм, гладкі або дрібнобугорчасті. Оптимальна температура росту 25 град.С.
2.9. Всі вказані вище мікроміцети та дріжджеподібні гриби добре ростуть на агаризованих середовищах промислового виробництва, які використовують для вирощування грибів, серед них найчастіше вживані середовища Сабуро та Чапека.
3. Характеристика методу визначення.
3.1. Метод визначення мікроскопічних грибів у воді ґрунтується на посіві проб води на специфічне агаризоване поживне середовище з подальшою інкубацією, підрахунком і ідентифікацією вирослих колоній. Методика включає підготовку проб води, фільтрацію через мембранні фільтри, які потім накладаються на поверхню агаризованого поживного середовища Сабуро з дихлораном з подальшою інкубацією.
3.2. Як відомо гриби мають схильність до повзучого росту і тому їх колонії при рості на поживному середовищі зливаються, суцільно заполоняючи всю чашку Петрі, що не дає змоги підрахувати кількість грибів в досліджуваному об'єкті.
Щоб запобігти повзучому росту грибів, який утруднює підрахунок окремих колоній грибів, до середовища Сабуро перед стерилізацією додається дихлоран в концентрації 2 мкг/куб.см.
Дихлоран (C H CI N O - 4-нітро-2,6-дихлоранілін) - жовта
6 4 2 2 2 кристалічна речовина. Дихлоран не тільки запобігає повзучості грибів, але і зменшує швидкість росту колоній, що відображається на їх величині. Колонії на середовищі з дихлораном не зливаються в суцільний ріст, кожна колонія окремо сформована, що дозволяє провести підрахунок всіх вирослих на чашці Петрі колоній і оцінити ступінь забруднення досліджуваного об'єкту.
4. Відбір і підготовка проб води до аналізу
4.1. Проби води для дослідження відбираються загально прийнятими методами у спеціально призначені для такого відбору води стерильні флакони місткістю не менше 500 куб.см зі щільно закритими ковпачками згідно ГОСТ 18963-73 (ГОСТ 18963-73. Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа.- М.: Госстандарт СССР.-1973). Проби води з водорозбірних кранів відбирають після їх стерилізації шляхом фламбування тампоном, змоченим спиртом, і наступного спускання води впродовж 10-15 хвилин при повністю відкритому крані. Відібрані проби маркують. Доставка проб здійснюється в продезінфікованих термоконтейнерах при температурі 6+2 С. В холодний період року контейнери повинні мати терморегулюючі прокладки, що запобігають промерзанню проб. При дотриманні вказаних умов термін початку дослідження не повинен перевищувати 6 годин.
5. Проведення досліджень
5.1. Перед дослідженням пробу води ретельно перемішують. Край ємності фламбують для запобігання можливого вторинного забруднення, яке може мати місце при транспортуванні. Проби води підлягають фільтруванню.
5.2. Для фільтрування використовують мембранні фільтри з діаметром пор 0,47 мкм (Владіпор) або нітроцелюлозні мембрани з порами 0,5 мкм. Перед фільтруванням в день посіву фільтри стерилізують кип'ятінням або іншим способом, рекомендованим фірмою-виробником. Підготовлені фільтри використовують впродовж робочого дня.
5.3. Лійку та столик фільтрувального апарату протирають ватним тампоном, змоченим спиртом і стерилізують фламбуванням. Після охолодження на столик фільтрувального апарату стерильним пінцетом накладають підготовлений мембранний фільтр, притискуючи його лійкою, яку закріплюють пристроєм, передбаченим конструкцією приладу.
5.4. Після фільтрування лійку знімають, стерильним пінцетом фільтр переносять, не перевертаючи, на поверхню поживного середовища в чашках Петрі. На одній чашці розміщується один фільтр. На дні чашки роблять напис із зазначенням об'єму профільтрованої води, дати посіву і номера проби.
5.5. Об'єми води, які фільтрують через фільтр, залежать від передбачуваного ступеня обсіменіння води мікроміцетами (від 10 до 100 куб.см).
5.6. Чашки з фільтрами інкубують в термостаті при 26-28+1 град.С впродовж 7 діб, підраховуючи колонії щоденно. Для попередження висихання агару в чашці останні слід розміщувати в спеціальні контейнери або целофанові пакети.
6. Облік результатів
6.1. Підраховують кількість вирослих колоній мікроміцетів, враховуючи кратність розведення проб. Результат виражають в колонієутворюючих одиницях (КУО) в 100 куб.см досліджуваної проби води.
6.2. Проводять ідентифікацію мікроміцетів за морфологічними та біохімічними ознаками, наведеними у пунктах 2.1-2.8.
7. Обладнання, засоби вимірювальної
техніки, реактиви, матеріали
7.1. Обладнання, засоби вимірювальної техніки:
прилади для мембранної фільтрації під вакуумом різних конструкцій та виробників, зареєстровані в Україні у відповідності з законодавством;
термостат електричний з автоматичним терморегулятором ТС-80 та інші аналогічні марки;
стерилізатор паровий медичний, ГОСТ 19569;
дистилятор електричний, що забезпечує якість дистильованої води згідно з ГОСТ 6709-72, або прилад для отримання води аналітичної якості;
мікроскоп світловий, ГОСТ 8074;
плитка електрична, ГОСТ 14919 або газова плита;
холодильники побутові;
терези лабораторні 2-го класу точності з комплектом гир, ГОСТ 24104-88;
терези лабораторні 4-го класу точності з комплектом гир з похибкою не більше 15 мг;
рН-метр з похибкою вимірювання +- 0,01 рН;
термометр скляний, ГОСТ 27544-87, ціна поділки 1 град.С, гранично допустима похибка не більше 0,5 град.С;
сумки-холодильники або інша термоізолююча тара;
спиртівки СЛ-1 чи СЛ-2 згідно з ГОСТ 25336, чи пальники газові;
годинник піщаний, ГОСТ 10576 або таймер;
анатомічні пінцети для роботи з мембранними фільтрами;
петлі бактеріологічні;
штатив пластмасовий ГОСТ 12026 чи металевий;
скальпель, ГОСТ 21240;
шпатель, ГОСТ 10778;
колби за ГОСТ 1770-74;
чашки Петрі, ГОСТ 25336 або пластикові;
скельця предметні, ГОСТ 9284;
скельця покривні, ГОСТ 6672;
піпетки, ГОСТ 29227;
пробірки ГП-16-150 за ГОСТ 25336;
склянки, циліндри мірні, ГОСТ 177-;
лійки, ГОСТ 25336;
мембранні фільтри з діаметром пор 0,47 мкм (Владіпор) або нітроцелюлозні мембрани з діаметром пор 0,5 мкм або аналогічні мембранні фільтри, які мають міжнародний сертифікат якості ISO 9000 чи EN 29000;
ємкості для приготування поживних середовищ;
олівці або фломастери по склу;
вата бавовняна медична гігроскопічна;
папір фільтрувальний;
марля медична.
7.2. Реактиви та поживні середовища:
агар-агар мікробіологічний, ГОСТ 17206-84;
бромтимолблау;
глюкоза, ГОСТ 6038-79;
гліцерин;
Дихлоран (C 6H 4CI 2N 2O 2- 4-нітро-2,6-дихлоранілін);
дріжджі пекарські;
дріжджовий екстракт;
залізо сірчанокисле закисне, ГОСТ 4148-78;
кислота соляна, ГОСТ 3118-77;
лактоза, ГОСТ 6038-74;
натрій азотнокислий, ГОСТ 4197-74;
натрій хлористий, ГОСТ 4233-77;
сахароза, ГОСТ 5833-75;
спирт етиловий ректифікований 96%, ГОСТ 5962-67.
Допускається використання інших засобів вимірювальної техніки, допоміжного обладнання, приладів, реактивів, матеріалів яки за характеристиками не поступаються зазначеним вище.
8. Приготування диференційно-діагностичних середовищ.
8.1. Приготування середовища Сабуро з дихлораном.
Основою середовища є дріжджова вода. Для її приготування на 1 куб.дм водогінної води беруть 80 г пекарських дріжджів (або 20 г сухих), кип'ятять 15 хвилин, фільтрують через паперовий фільтр і розливають по флаконам та стерилізують при 1 атмосфері впродовж 20 хвилин. До 100 куб.см стерильної дріжджової води додають 1% пептону, 2% агару, нагрівають на водяній бані до розплавлення агару, добавляють 4% глюкози (або мальтози), фільтрують та стерилізують впродовж 30 хвилин при 0,5 атмосфери. Дихлоран додається у середовище в кількості 0,002 г/куб.дм перед стерилізацією середовища. Дозволяється використовувати сухі промислові поживні середовища для вирощування мікроміцетів, які застосовуються в Україні, з додаванням до них 0,002 г/куб.дм дихлорану.
8.2. Приготування середовища Чапека.
На 1 куб.дм дистильованої води додають 30 г сахарози (глюкози чи гліцерину), NaN0 3- 2,0 г, К 2НРО 4- 1,0 г, МgS0 4x 7 Н 2О - 5,0 г, КС1 - 0,5 г, FeSО 4 x 7 Н 2О - 0,1 г, агар-агар - 20,0 г, дріжджовий екстракт - 10 г, вода - 1 куб.дм. Середовище Чапека використовується, як правило, для ідентифікації мікроміцетів, що виросли на фільтрах; дихлоран в цьому випадку не вноситься.
9. Вимоги безпеки
Вимоги щодо техніки безпеки при роботі з мікроорганізмами забезпечуються згідно з Державними санітарними правилами "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю" (ДПС 9.9.5-080-02), затвердженими постановою Головного державного санітарного лікаря України від 28.01.2002 р. N 1.
Директор департаменту організації
санітарно- епідеміологічного нагляду Л.М.Мухарська