МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
НАКАЗ
N 96 від 15.04.98
м.Київ
( Наказ втратив чинність на підставі Наказу
Міністерства охорони здоров'я України
N 310 від 08.05.2014 )
Про удосконалення заходів щодо
попередження захворювань на
поліомієліт в Україні
( Із змінами, внесеними згідно з Наказом МОЗ
N 196 від 14.07.98 )
1988 року Всесвітня асамблея охорони здоров'я поставила завдання глобальної ліквідації поліомієліту до 2000 року. Цю ініціативу підтримали всі країни - члени ВООЗ.
З 1993 року в Західній півкулі припинено циркуляцію "диких" штамів поліовірусів і випадки захворювань на поліомієліт не реєструються.
За повідомленням ВООЗ, у Європейському регіоні 1997 року поліомієліт реєструвався лише у 2 країнах.
В Україні протягом 1991 - 1996 рр. спостерігалась висока захворюваність на поліомієліт. За цей період зареєстровано 36 випадків поліомієліту. Захворювання мали місце на 5 адміністративних територіях: Дніпропетровській, Івано-Франківській, Львівській, Чернігівській областях та м.Києві.
Особливостями поліомієліту в останні роки в Україні було зростання питомої ваги захворювань серед дорослих, тяжкий клінічний перебіг хвороби, наявність летальних випадків.
З метою зниження захворюваності на поліомієліт, припинення циркуляції "диких" штамів поліовірусів, на виконання розпорядження Президента України від 26.06.96 року N 175/96-рп "Про проведення імунізації дітей проти поліомієліту" в Україні проведено дні імунізації дітей. І в результаті досягнуто високого рівня охоплення дітей щепленнями і зниження захворюваності на поліомієліт. 1997 року випадків паралітичного поліомієліту в Україні не зареєстровано.
Для удосконалення заходів щодо попередження від поліомієліту наказую:
1. Затвердити:
1.1. ( Пункт 1.1 втратив чинність на підставі Наказу МОЗ N 196 від 14.07.98 ) Методичні рекомендації "Організація епідеміологічного нагляду за поліомієлітом" (додається).
1.2. Методичні рекомендації "Вірусологічна діагностика поліомієліту" (додається).
1.3. Методичні рекомендації "Клінічна діагностика поліомієліту" додається).
1.4. ( Пункт 1.4 втратив чинність на підставі Наказу МОЗ N 196 від 14.07.98 ) Склад комісії для заключної оцінки випадків гострих в'ялих паралічів (додається).
1.5. ( Пункт 1.5 втратив чинність на підставі Наказу МОЗ N 196 від 14.07.98 ) Склад комісії по підготовці до сертифікації України як території, вільної від поліомієліту (додається).
2. ( Пункт 2 втратив чинність на підставі Наказу МОЗ N 196 від 14.07.98 ) Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Київської та Севастопольської міських держадміністрацій забезпечити:
2.1. Охоплення щепленнями проти поліомієліту дітей до 14 років відповідно до діючого календаря щеплень згідно з наказом МОЗ від 25.01.96 N 14 "Про затвердження Календаря профілактичних щеплень, Переліку протипоказань до щеплень, Основних положень про організацію та проведення профілактичних щеплень, Форми подачі інформації про випадок побічної дії (ускладнення) після застосування імунобіологічних препаратів, Переліку можливих ускладнень і термінів їх виникнення після щеплень, що підлягають подальшому розслідуванню".
2.2. Облік та своєчасне якісне обстеження всіх хворих на гострі в'ялі паралічі, включаючи вірусологічні та серологічні дослідження.
2.3. Вивчення стану колективного імунітету до поліомієліту та циркуляції поліовірусів серед населення і в об'єктах довкілля.
2.4. Дотримання "холодового ланцюга" при транспортуванні, зберіганні та використанні поліомієлітної вакцини та проб для вірусологічних досліджень тощо.
2.5. Щотижневу подачу звітів лікувальними закладами про наявність або відсутність випадків гострих в'ялих паралічів до територіальної санепідстанції згідно з методичними рекомендаціями "Організація епідеміологічного нагляду за поліомієлітом".
2.6. Ретельне епідеміологічне та вірусологічне обстеження кожного випадку гострого в'ялого паралічу у дітей до 15 років.
2.7. Доставку первинного матеріалу від дітей до 15 років з гострими в'ялими паралічами, всіх ізольованих штамів ентеровірусів від хворих людей та з об'єктів довкілля разом з вихідним матеріалом в Українську референс-лабораторію з поліомієліту для подальшого дослідження.
3. ( Пункт 3 втратив чинність на підставі Наказу МОЗ N 196 від 14.07.98 ) Головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва і Севастополя, на водному, залізничному, повітряному транспорті забезпечити:
3.1. Здійснення протиепідемічних заходів при поліомієліті та гострих в'ялих паралічах.
3.2. Роботу вірусологічних лабораторій з діагностики поліомієліту, вивчення стану колективного імунітету та вірусологічне обстеження об'єктів довкілля відповідно до діючих нормативних документів.
3.3. Ретельний контроль за повнотою охоплення щепленнями проти поліомієліту дітей згідно з діючим календарем щеплень.
4. ( Пункт 4 втратив чинність на підставі Наказу МОЗ N 196 від 14.07.98 ) Начальнику Головного економічного управління Барановій Т.Ф. передбачити фінансування Української референс-лабораторії з поліомієліту за рахунок коштів, передбачених на фінансування Національної програми імунопрофілактики населення на 1993-2000 рр.
5. ( Пункт 5 втратив чинність на підставі Наказу МОЗ N 196 від 14.07.98 ) Директору Української референс-лабораторії з поліомієліту Широбокову В.П.:
5.1. Проводити вірусологічне дослідження первинного матеріалу від дітей з гострими в'ялими паралічам та осіб, що з ними спілкувалися.
5.2. Організувати роботу по з'ясуванню природи циркулюючих поліовірусів та інших ентеровірусів.
5.3. Надавати методичну допомогу вірусологічним лабораторіям санепідстанцій.
5.4. Забезпечувати вірусологічні лабораторії обласних, міських санепідстанцій паспортизованими еталонними вакцинними штамами поліовірусів типів 1, 2 і 3 та лабораторними лініями перещеплюваних культур клітин.
5.5. Співпрацювати з Європейським регіональним бюро ВООЗ, вірусологічною лабораторією ВООЗ (Копенгаген), Регіональною референс-лабораторією (Росія) з питань лабораторної діагностики поліомієліту, розробки стратегії і тактики ліквідації поліомієліту в Україні.
6. ( Пункт 6 втратив чинність на підставі Наказу МОЗ N 196 від 14.07.98 ) Директору Київського НДІ епідеміології та інфекційних хвороб Сельніковій О.П.:
6.1. Здійснювати науковий аналіз епідемічної ситуації з поліомієліту.
6.2. Надавати консультативну та методичну допомогу фахівцям санітарно-епідеміологічної служби з питань епіднагляду та профілактики поліомієліту.
6.3. Проводити наукові розробки з питань епідеміології поліомієліту на надавати обгрунтовані рекомендації щодо профілактики цієї інфекції.
6.4. Здійснювати підготовку звітності для ВООЗ з питань епідеміологічного нагляду за гострими в'ялими паралічами та поліомієлітом.
7. ( Пункт 7 втратив чинність на підставі Наказу МОЗ N 196 від 14.07.98 ) Виконуючому обов'язки головного лікаря Українського центру держсанепіднагляду України Марценюку М.І.:
7.1. Здійснювати аналіз епідситуації з поліомієліту та ефективності імунопрофілактики в країні.
7.2. Надавати організаційно-методичну допомогу санепідстанціям у проведенні протиепідемічних заходів при захворюванні на поліомієліт та гострі в'ялі паралічі.
7.3. Узагальнювати щотижневу інформацію про кількість випадків поліомієліту та ГВП для подання до ВООЗ та Київського НДІ епідеміології та інфекційних хвороб.
8. ( Пункт 8 втратив чинність на підставі Наказу МОЗ N 196 від 14.07.98 ) Начальнику Головного управління закладів освіти Вороненку Ю.В. забезпечити підготовку лікарів зі спеціальностей - неврологія, інфекційні хвороби, педіатрія, вірусологія, епідеміологія, з питань діагностики, лікування і профілактики поліомієліту та інших ентеровірусних інфекцій у закладах післядипломної освіти.
9. ( Пункт 9 втратив чинність на підставі Наказу МОЗ N 196 від 14.07.98 ) Генеральному директору державного підприємства "Укрвакцина" Брую Г.Ф.:
9.1. Узагальнювати та аналізувати річні заявки регіонів на поліомієлітну вакцину та забезпечити закупівлю, зберігання і транспортування поліомієлітної вакцини гарантованої якості в режимі "холодового ланцюга".
10. ( Пункт 10 втратив чинність на підставі Наказу МОЗ N 196 від 14.07.98 ) Вважати такими, що:
10.1. Не застосовуються на території України - "Инструкция по профилактике полиомиелита в СССР", Москва, 1984 г., наказ МОЗ СРСР від МОЗ СРСР від 21.07.89 N 430 "Об организации и проведении мероприятий по ликвидации полиомиелита в СССР".
10.2. Втратив чинність наказ МОЗ УРСР від 02.11.89 N 221 "Об осуществлении мероприятий по дальнейшему снижению заболеваемости полиомиелитом в Украинской СССР".
11. Контроль за виконанням наказу покласти на першого України Некрасову Л.С.
Міністр А.М.Сердюк
Затверджено
наказ Міністерства охорони здоров'я
України від 15.04.1998 N 96
( Методичні рекомендації втратили чинність на підставі
Наказу МОЗ N 196 від 14.07.98 )
Методичні рекомендації
Організація епідеміологічного нагляду за
поліомієлітом
Поліомієліт - гостра інфекційна хвороба, яку спричиняють поліовіруси типів 1, 2, 3, з діапазоном захворювань від неспецифічних симптомів до паралічів з можливою наступною інвалідністю. Інкубаційний період становить від 2 до 35 діб. Єдиним джерелом інфекції є людина. Механізм передачі збудника поліомієліту є фекально-оральний та повітряно-крапельний.
"Підозрілим на поліомієліт" вважають гострий, тобто з швидким розвитком (протягом 1-3 днів), в'ялий параліч (ГВП), у тому числі синдром Гійєна - Барре, у дитини віком до 15 років або схоже з поліомієлітом паралітичне захворювання у людини будь-якого віку.
Якщо при епідеміологічному розслідуванні одразу виявлено очевидну причину паралічу (наприклад, травма), діагноз "підозрілий випадок" відміняють і епідеміологічне розслідування припиняють, хворий отримує відповідне лікування та проходить курс реабілітації.
Якщо при розслідуванні "підозрілого" випадку лікар-іфекціоніст, невролог та епідеміолог не можуть одразу встановити вірогідну причину паралічу, такий випадок переходить з категорії "підозрілого" до категорії "ймовірний випадок" і епідеміологічне розслідування продовжується. "
"Ймовірний випадок"- це тимчасовий діагноз, який протягом 12 тижнів від початку паралічу повинен бути замінений комісією для заключної оцінки випадків ГВП на "підтвержений поліомієліт", "поліомієлітноподібне захворювання" або відмінений.
За рекомендаціями ВООЗ з січня 1997 року в Європі введено нове стандартне визначення випадку поліомієліту, згідно з яким тільки випадок гострого в'ялого паралічу, при якому виділено поліовірус, класифікується як поліомієліт.
Класифікація інших випадків ГВП проводиться з урахуванням одного або більше наступних критеріїв:
- летальний кінець хвороби;
- залишковий в'ялий параліч після 60 днів;
- втрата спостереження за хворим;
- повнота вірусологічного обстеження (дві проби випорожнень протягом 14 днів від початку ГВП).
Враховуючи зазначені критерії, випадок ГВП класифікується як поліомієлітоподібне захворювання, якщо вірусологічне обстеження проведено не повністю, але:
- залишковий в'ялий параліч зберігається більше 60 днів,
- втрачено спостереження за хворим,
- хворий помер,
- коли комісія для заключної оцінки випадків ГВП вирішує, що випадок слід класифікувати як поліомієлітоподібне захворювання.
Всі випадки поліомієлітоподібних захворювань слід розглядати як недоліки у системі епіднагляду. Кожен з них повинен ретельно аналізуватися, що відповідає рекомендаціям ВООЗ.
Епідеміологічний нагляд за поліомієлітом та ГВП включає збір та аналіз інформації про випадки ГВП та поліомієліту, стан колективного імунітету до поліовірусів, лабораторний контроль за циркуляцією поліовірусів з метою обгрунтування і проведення необхідних профілактичних, та протиепідемічних заходів, спрямованих них на припинення циркуляції "диких" поліовірусів.
Для реалізації зазначеної мети необхідно забезпечити: своєчасне виявлення, лабораторне обстеження кожного ймовірного випадку поліомієліту для підтвердження або спростування діагнозу поліомієліту, високий рівень охоплення (98-100%) профілактичними щепленнями дітей згідно з календарем щеплень, проведення епідеміологічного аналізу з оцінкою ефективності протиепідемічних та профілактичних заходів.
Епідеміологічний нагляд здійснюється на кожній території. Роботу по виявленню випадків ГВП, їх діагностиці, лікуванню хворих, вірусологічному та серологічному обстеженню очолюють: головний педіатр, головні іфекціоністи, головні неврологи і епідеміолог. Епідеміолог санепідстанції відповідає за розробку плану заходів щодо реалізації програми епіднагляду, узагальнює та аналізує його результати, розробляє відповідні рекомендації, надає звіти.
Сертифікація України, як держави вільної від поліомієліту, неможлива без якісного спостереження за випадками ГВП у дітей віком до 15 років та їх вірусологічного обстеження.
У зв'язку з цим випадок ГВП, у тому числі синдром Гійєна-Барре, у дитини віком до 15 років повинен бути зареєстрований, відповідно обстежений і остаточно класифікований.
Підозрілим на поліомієліт слід вважати гострий в'ялий моно-, пара- і тетрапарез, що розвивається протягом 1-3 днів. Гострі неврити лицевого нерву теж підпадають під категорію підозрілого випадку при їх резистентності до терапії протягом двох тижнів і при підозрі на ураження ядра лицевого нерву.
Усі діти з ГВП госпіталізуються у встановленому порядку до інфекційного відділення дитячої центральної районної або міської лікарні, де лікар-інфекціоніст надає повідомлення про випадок ГВП до районної СЕС як по телефону, так і письмово, звідки, у свою чергу, повідомляється про випадок до обласної СЕС (додаток 1). Кожній дитині віком до 15 років, хворій на ГВП, на яку надходять повідомлення, епідеміологом обласного рівня присвоюється епідномер (додаток 2). Обласна СЕС надсилає до МОЗ України та Українського центру держсанепіднагляду (УЦДСЕН) повідомлення про випадок ГВП, а у подальшому про спростування або підтвердження діагнозу. Протягом 48 годин випадок ГВП, який вважається підозрілим на поліоміоєліт, розслідується епідеміологом (додаток 3), і разом з лікарем-інфекціоністом та неврологом вирішується питання про спростування діагнозу або переводу випадку до категорії "ймовірний". В останньому разі від хворого отримують першу пробу фекальних мас (2 флакони), а через 24-48 годин - другу (2 флакони). Всі проби доставляють з дотриманням холодового ланцюга до відповідної територіальної вірусологічної лабораторії СЕС для дослідження. Парні сироватки крові хворих відбирають з інтервалом 2-3 тижні для визначення рівнів віруснейтралізуючих антитіл до поліовірусів. У вірусологічній лабораторії СЕС досліджується по 1 флакону кожної проби фекальних мас та сироватки крові. Інші флакони фекальних мас терміново надсилають до Української референс-лабораторії з поліомієліту (УРЛП) для паралельного дослідження.
Від хворих з гострим невритом лицевого нерву, які госпіталізовані до інфекційних або неврологічних відділень, також відбирають 2 проби фекальних мас, які зберігають при температурі - 20 град.С. Якщо терапевтичні заходи не ефективні протягом 2 тижнів лікування чи виявлені ураження ядра лицевого нерву, то відібрані проби фекальних мас надсилаються до вірусологічної лабораторії. Одночасно на на такі випадки надається повідомлення. Випадку надається епідномер, але з поміткою "f" наприкінці.
В осередку "ймовірного" випадку поліомієліту проводять епідеміологічне обстеження, заключну дезінфекцію та аналіз даних профілактичних щеплень проти поліомієліту осіб, які спілкувалися з хворим. Дітям до 14 років, які не щеплені у встановлені строки у зв'язку з тимчасовими протипоказаннями, щеплення проводять за індивідуальною схемою згідно з рекомендаціями відповідних спеціалістів (Наказ МОЗ України від 25.01.96 N 14 "Основні положення про організацію та проведення профілактичних щеплень").
Щеплення проводять після відбору проб фекальних мас (по 2 флакони) від 5 дітей віком до 5 років, що спілкувались з хворим. При відсутності дітей зазначеного віку обстежують осіб інших вікових груп. Проби направляють на дослідження паралельно до УРЛП та територіальної вірусологічної лабораторії СЕС.
Для проб фекальних мас осіб, що спілкувалися з хворим, слід надавати той же самий епідномер, що і для хворого. Різниця полягає в тому. що в кінці додається номер "С1"-для позначення першої особи, "С2"-другої тощо.
Діаграма розслідування випадків ГВП у дітей, збору матеріалу та відповідних заходів наведена у додатку 4.
Спостерження останніх років свідчать про те що випадки поліомієліту мають місце і серед дорослих. З метою не пропустити захворювання на поліомієліт серед цієї категорії населення необхідним є обстеження випадків підозри на поліомієліт (ГВП та гострого невриту лицевого нерву) з клінічним перебігом, подібним тому, який визначається у дітей та при якому відсутня інша причина захворювання.
Від дорослих з ГВП матеріал відбирають за аналогічною методикою, але досліджують його лише у вірусологічних лабораторіях обл/міськ СЕС. Вихідний матеріал (проби фекальних мас та сироватки крові) зберігають у вірусологічних лабораторіях до кінця досліджень, а в разі позитивного результату (виділення вірусу, 4-х кратного зростання титрів антитіл, при виявленні високих рівнів антитіл до поліовірусу- 1:128 і вище у випадку пізнього взяття першої сироватки крові) одночасно з виділеним штамом поліо- або іншого ентеровірусу направляють до УРЛП.
Для повноти виявлення випадків поліомієліту додатковими є вірусологічні дослідження носоглоткових змивів, секційного матеріалу, при нагоді ліквору. Термін взяття матеріалу, умови його зберігання вказано у додатку 5. Наявність вірусів у зазначеному матеріалі, зростання титрів віруснейтралізуючих антитіл у сироватках крові в 4 рази і більше свідчить на користь поліовірусної етіології захворювання. Дослідження додаткового матеріалу здійснюється в вірусологічних лабораторіях санепідслужби.
Санепідстанції Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя, на водному, залізничному, повітряному транспорті не пізніше 70 днів від дня появи паралічів направляють до Головного санітарно-епідеміологічного управління МОЗ України копії карти епідеміологічного обстеження хворого на поліомієліт або ГВП, а при необхідності - копії історії хвороби.
Діагноз підтверджується або спростовується комісією для заключної оцінки випадків ГВП. На кожний випадок захворювання надається заключна класифікація (додаток 2).
Лікувально-профілактичні заклади, в які госпіталізуються діти з ГВП, повинні до 30 числа кожного місяця подати до територіальної районної СЕС відомості про кількість випадків ГВП у дітей до 15 років або про їх відсутність. Щотижнево СЕС Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя, на водному, залізничному, повітряному транспорті направляють одночасно до УЦДСЕН та Київського НДІ епідеміології та інфекційних хвороб (КНДІЕІХ) дані про випадки ГВП у дітей за схемами (додаток 6). Щотижнева інформація повинна містити відомості про всі випадки ГВП у дітей, починаючи з січня поточного року. Узагальнені матеріали щотижнево надсилаються Міністерством охорони здоров'я до ВООЗ.
При проведенні епідеміологічного нагляду за поліомієлітом слід також здійснювати перевірку повноти виявлення випадків ГВП у дітей в лікувальних та реабілітаційних закладах. З цією метою необхідно перевіряти історії хвороби амбулаторних та стаціонарних хворих, особливо в інфекційних, неврологічних, фізіотерапевтичних відділеннях лікарень, відділі медичної статистики.
З метою оцінки якості епідеміологічного нагляду за ГВП, що буде ураховуватися в подальшому при сертифікації території як вільною від поліомієліту, необхідної здійснювати оцінку своєчасності та повноти інформації про випадки ГВП у дітей, для чого на рівні району проводиться аналіз по кожному лікувально-профілактичному закладу (додатки 7, 8). Обласні СЕС здійснюють аналіз повноти та своєчасності інформації про випадки ГВП у дітей по районам області (додатки 7, 8). Показники повноти та своєчасності інформації про випадки ГВП у дітей повинні бути не менше 80%. Результати аналізу повноти та своєчасності інформації доводити до відома керівників лікувально-профілактичних закладів.
Для забезпечення оцінки епідемічної ситуації необхідно своєчасно виявляти та проводити лабораторну діагностику захворювань, етіологія яких може бути пов'язана з поліовірусами чи іншими ентеровірусами.
З метою профілактики поліомієліту в Україні проводяться щеплення поліомієлітною вакциною дітей згідно з календарем щеплень. При порушенні календаря щеплень, у зв'язку з тимчасовими протипоказаннями, щеплення проводять за індивідуальною схемою згідно з рекомендаціями відповідних спеціалістів (Наказ МОЗ України від 25.01.96 N 14) "Основні положення про організацію та проведення профілактичних щеплень").
Транспортування поліомієлітної вакцини здійснюється в холоді з використанням машин - рефрижераторів, термосів з льодом чи в сумках - холодильниках. Постійний запас вакцин повинен знаходитись у спеціальних камерах, морозильниках при температурі - 15 град.С - 25 град.С. Районні й міські санепідстанції одержують вакцину і за потребою видають її лікувально-профілактичним закладам, де вона зберігається у побутових холодильниках при +2 град.С - +8 град.С. Створювати запаси вакцини забороняється, вона повинна використовуватися протягом 30 днів.
Для оцінки ефективності імунопрофілактики населення проти поліомієліту вірусологічні лабораторії СЕС проводять відбіркові дослідження стану специфічного імунітету і щорічно надсилають відомості до КНДІЕІХ за схемою (додаток 9).
Умовно захисними титрами віруснейтралізуючих антитіл до поліовірусів вважають титри 1:8-1:16.
З метою вивчення циркуляції поліовірусів серед населення та в об'єктах довкілля вірусологічні лабораторії санепідстанцій проводять планове обстеження дітей організованих колективів (проби фекальних мас) та дослідження проб стічних вод, води відкритих водоймищ, питної води та продуктів харчування (виготовлених молокозаводами, дитячими молочними кухнями та овочів з полів зрошення).
Щоквартально вірусологічні лабораторії санепідстацій Автономної республіки Крим, областей, міст Києва і Севастополя направляють звіт до КНДІЕІХ (додаток 10).
Загальне керівництво за проведенням епідеміологічного нагляду за поліомієлітом здійснює КНДІЕІХ та УЦДСЕН.
Додаток 1
до методичних рекомендацій
Організація епідеміологічного
нагляду за поліомієлітом
Повідомлення про випадок ГВП або підозри на поліомієліт.
(підкреслити необхідне)
1. Прізвище, ім'я та по батькові ____________________________
2. Вік (дата, місяць і рік народження) ______________________
3. Стать ____________________________________________________
4. Адреса ___________________________________________________
5. Хворий місцевий, приїжджий (звідки і коли прибув) ________
_____________________________________________________________
6. Дата захворювання ________________________________________
7. Дата появи паралічу ______________________________________
8. Дата звернення за допомогою, місце звернення, початковий
діагноз __________________________________________________
9. Дата і місце госпіталізації ______________________________
10. Клінічні ознаки, на підставі яких поставлено діагноз
поліомієліту або ГВП _____________________________________
11. Отримані щеплення проти поліомієліту (дата, доза, серія
препарату тощо) __________________________________________
12. Якщо хворий спілкувався з щепленим проти поліомієліту,
вказати, коли щеплений отримав вакцину ___________________
13. Дата забору матеріалу від хворого ________________________
14. Установа, до якої направлено або буде направлено матеріал
від хворого для вірусологічного дослідження, дата ________
Прізвище та посада особи, що надіслала повідомлення
______________________________________________________________
______________________________________________________________
Додаток 2
до методичних рекомендацій
Організація епідеміологічного
нагляду за поліомієлітом
Заключна класифікація випадку захворювання
на поліомієліт або ГВП
(заповнюється Комітетом експертів)
Дата ______ Країна _______________ Епідномер UKR* ___________
Прізвище, ім'я, по батькові хворого _________________________
------------------------------------------------------------------
Заключна класифікація | підтверджений поліомієліт
випадку |-----------------------------------
(відмітити тільки одне): | відмінений
|-----------------------------------
| поліємілітоподібне захворювання
------------------------------+-----------------------------------
Класифіковано на підставі: | поліовірус у зразках фекалій,
(відмітити все необхідне) | зібраних адекватним чином
|-----------------------------------
| нема поліовірусу у зразках фекалій
| зібраних адекватним чином
|-----------------------------------
| поліовірус у зразках фекалій,
| зібраних неадекватним чином
|-----------------------------------
| поліовірус в інших зразках
| матеріалу (вказати, в якому)
|-----------------------------------
| результати досліджень сироваток,
| відібраних адекватним чином
|-----------------------------------
| результати досліджень сироваток,
| відібраних неадекватним чином
|-----------------------------------
|нема поліовірусу у зразках фекалій
|зібраних неадекватним чином
|-----------------------------------
|резидуальні паралічі після 60 діб
|-----------------------------------
| хворий помер від поліомієлітного
| захворювання
|-----------------------------------
| результати аутопсії
|-----------------------------------
| втрачено з-під нагляду після
| поліомієлітного захворювання
------------------------------+-----------------------------------
Якщо поліомієліт підтверджено,| місцевий
вказати тип (відмітити тільки |-----------------------------------
одне): | завізний
|-----------------------------------
| вакциноасоцийований
|-----------------------------------
| невідомий
------------------------------+-----------------------------------
Заключний діагноз, якщо |
діагноз поліомієліту відмінено|
------------------------------------------------------------------
Підпис голови Комітету експертів
* Перші 3 літери означають код країни. Четверта та п'ята - код
адміністративної території. Шостий та сьомий знаки - дві
останні цифри року. Восьмий, дев'ятий та десятий знаки
- порядковий номер випадку (хворого).
Додаток 3
до методичних рекомендацій
Організація епідеміологічного
нагляду за поліомієлітом
Карта епідеміологічного обстеження хворого
на поліомієліт або гострий в'ялий параліч
1. Епідномер URK _________________________________________________
2. Дата розслідування випадку ____________________________________
3. Прізвище, ім'я та по-батькові _________________________________
Стать __________ Ч ____________ Ж _____________________________
4. Дата народження _______________________________________________
5. Адреса (якщо приїжджий - звідки і коли)
_______________________________________________________________
6. Місце роботи батьків __________________________________________
7. Щеплення проти поліомієліту (дати і серії вакцини) ____________
_______________________________________________________________
8. Яку дитячу установу відвідує (дитяча дошкільна, школа, ПТУ,
тощо), місце роботи (для дорослих) ____________________________
дата останнього відвідування __________________________________
9. Чи виїжджав за 1,5 місяця до захворювання до іншого населенного
пункту,коли ___________________________________________________
куди __________________________________________________________
хто приїжджав _____________ , коли, ___________________________
звідки ________________________________________________________
10. Спілкування з вакцинованими ОПВ протягом останніх 2 міс.
______________________________________________________________
коротка характеристика, дата _________________________________
11. Чи купався у відкритому водоймищі або басейні останні 35 днів,
коли, характеристика водоймища _______________________________
12. Чи вживав колодязну, артезіанську воду для
пиття ________________________________________________________
коли _______________ який санітарно-гігієнічний стан
джерела ______________________________________________________
13. Чи вживав овочі з полів зрошування ___________________________
14. Якщо хворий немовля, то на якому харчуванні, чи
використовували продукти молочної кухні ______________________
15. На що хворів протягом останнього місяця (дата) _______________
16. Дата захворювання ____________________________________________
симптоми _____________________________________________________
17. Дата звернення до лікаря ___________________________________
діагноз ______________________________________________________
18. Дата госпіталізації _________ де _____________________________
діагноз ______________________________________________________
19. Ким поставлений (прізвище) ___________________________________
N історії хвороби ____________________________________________
20. Дата повідомлення про випадок ______________________________
21. Початок хвороби: з лихоманки, без лихоманки, ліквор нормальний
(підкреслити), плеоцитоз (цифра) ___________ , білок
(цифра _______________________________________________________
22. Дата початку паралічу ________________________________________
23. Локалізація парезу або паралічу: ліва нога, права нога, ліва
рука, права рука, тулуб, обличчя, шия, інше (вказати)______
______________________________________________________________
-- м'язовий тонус: підвищений, знижений, нормальний.
-- сухожильні рефлекси: відсутні, знижені, незмінені.
-- хода: паретично-спастична, в'яла.
Для кінцівок:
порушення функцій по дистальному, проксимальному типам
(підкреслити)
дихальні м'язи _______________________________________________
24. Дата повторного клінічного обстеження _____________________
25. Заключний діагноз (локалізація рухових порушень, паралічі або
парези, тяжкість) ____________________________________________
Поліомієліт або поліомієлітоподібне захворювання
(підкреслити), якщо інший діагноз, вказати який, _____________
дата _________________________________________________________
26. Дата виписки__________________________________________________
27. Кінець захворювання: одужання без залишкових явищ, із
залишковими явищами, асиметрія обличчя, кульгавість, атрофія
м'язів, без підтримки не сидить, не стоїть, не ходить
(підкреслити).
Летальний кінець, паталогоанатомічний діагноз__________________
дата___________________________________________________________
28. Лабораторні дані:
назофарингеальні змиви (дата забору, результат)__________________,
фекалії (дата забору, результат) 1 ____________ 2 _______________,
ліквор (дата забору, результат) _________________________________,
секційний матеріал (дата, результат) _____________________________
1 сироватка (дата забору) ______ 2 сироватка (дата забору) ______
3 сироватка (дата забору) _______
Титри віруснейтралізуючих антитіл до поліовірусів
Типу 1:
1 сироватка _______ ,2 сироватка __________ ,3 сироватка _________
Типу 2:
1 сироватка _______ ,2 сироватка __________ ,3 сироватка _________
Типу 3:
1 сироватка _______ ,2 сироватка __________ ,3 сироватка _________
29. Оцінка через 60 діб (видужання, залишковий параліч, летальний
кінець, втрачений з-під нагляду, інше) ___________________________
Карта складена (дата) __________
Прізвище ________________________ телефон ________________________
Додаток 4
до методичних рекомендацій
Організація епідеміологічного
нагляду за поліомієлітом
Діаграма розслідування випадку ГВП, збору зразків
фекальних мас та імунізації в осередку захворювання
--------------------
| Початок паралічу |
--------------------
|
||/ <= 7 днів
---------------------------------- -----------------------
|Розслідувати підозрілий випадок |.....>| Спростувати діагноз |
|(<= 48 годин від повідомлення) | -----------------------
----------------------------------
|
||/ негайно
--------------------
|Рекласифікувати як|
|імовірний випадок |
--------------------
|
||/ негайно
-------------------------- ----------- ------------ -----------------------------
|Зібрати 2 зразки фекаль-|< 3 днів |Направити|< 28 днів | Отримати | |Ізоляти полівірусу направи-|
|них мас (<= 14 днів від |........>| зразки в|.........>|результати|....>|ти до регіональної референс|
| початку паралічу) | | УРЛП | | з УРЛП | |-лабораторі для внутрішньо-|
-------------------------- ----------- ------------ | типової диференціації |
| | -----------------------------
||/ негайно | |
------------------------------------- | |
|Імунізація в осередку захворювання | | ------------
| Виявлення додаткових випадків | ||/ ||/
------------------------------------- ------------------------------------
| | Заключна класифікація випадку |
||/ | комітетом експертів (< 12 тижнів)|
------------------------------------
Додаток 5
до методичних рекомендацій
Організація епідеміологічного
нагляду за поліомієлітом
Забір матеріалу від людей при підозрі на поліомієліт
-------------------------------------------------------------------------------------------------
N |Об'єкт | Строки забору | |
з/п |дослід- |---------------------------------| Умови зберіганя | Примітка
|жень | оптимальні | максимальні | і |
| |---------------------------------| транспортування |
| | обов'язкові дослідження | |
-----+-----------+---------------------------------+--------------------------+------------------
1 |Фекалії |протягом перших |протягом перших|Проби негайно помістити в|Кожна проба
|(два зразки|14 днів від |6 тижнів від |холодильник чи термокон- |містить 8-10 г
|з інтер- |початку паралічів|початку паралі-|тейнер при 0-8град.С. До- |фекалій
|валом |чи інших |чів чи інших |ставити в лабораторію за |
|24-48 год) |неврологічних |неврологічних |72 год., при неможливості |
| |проявів |проявів |заморозити при -20 град.С |
| | | |і відправити так |
-----+-----------+---------------------------------+--------------------------+------------------
| | додаткові дослідження | |
-----+-----------+---------------------------------+--------------------------+------------------
2 |Сироватка |Перша сироватка | |Транспортувати кров при |Якщо результати
|крові |в перші дні | |кімнатній температурі. |досліджень не
| |захворювання | |Зберігати сироватку крові |дозволяють зробити
| |(до 7 дня), друга| |при 0-8 град.С. |висновки, то взяти
| |- у період | |Тривале зберігання - |третю сироватку
| |реконвалесценції | |при - 20 град.С |після того, як
| |через 3 тижні | | |стане відомий
| |після першої | | |результат
-----+-----------+-----------------+---------------+--------------------------+------------------
3 |Назофарин- |протягом першого | | Проби негайно помістити |
|геальні |тижня | |в холодильник чи термокон-|
|змиви |захворювання | |тейнер при 0-8град.С. До- |
| | | |ставити в лабораторію за |
| | | |72 години,при неможливості|
| | | |заморозити при -20 град.С |
| | | |і відправити так |
-----+-----------+-----------------+---------------+--------------------------+-------------------
4 |Ліквор | | | -"- |У разі
| | | | |здійснення спино-
| | | | |мозкової
| | | | |пункції
-----+-----------+-----------------+---------------+--------------------------+-------------------
5 |Секційний |Час, що пройшов з| | -"- |У разі смерті
|матеріал |моменту смерті та| | |хворого
|(шматочки |розтину, | | |
|спинного і |визначається | | |
|головного |24 год. | | |
|мозку, | | | |
|кишок | | | |
| | | | |
--------------------------------------------------------------------------------------------------
Додаток 6
до методичних рекомендацій
Організація епідеміологічного
нагляду за поліомієлітом
Щотижнева форма надання даних з поліомієліту та гострих
в'ялих паралічів (на понеділок наступного тижня)
Область Дата Звіт на кінець неділі (дата) Відповідальний: посада, прізвище, ініціали Підпис
---------------------------------------------------------------------------------------------------
| | | | | |
---------------------------------------------------------------------------------------------------
------- -----
1. Число випаків ГВП до 15-річного віку | | 4. Число нових випадків за минулий тиждень,| |
з 1 січня поточного року | | які на думку лікар, мають відношення | |
2. Кумулятивне число випадків ГВП до 15- |-----| до поліомієміту |---|
річного віку з 1 січня поточного року,| | 5. Число випадків ГВП з новими ізолятами | |
при яких отримано не менше 2 проб | | поліовірусу за минулий тиждень | |
фекальних мас для вірусологічного | | | |
дослідження |-----| -----
3. Кумулятивне число підтверджених випад-| |
ків поліомієліту, починаючи з 1 січня | |
1998 року -------
Список усіх випадків ГВП, починаючи з 1 січня поточного року
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
N |Прізвище,|Обла-|Район|ОПВ|Дод.|Ост.|Д.на-|Дата|По-|ДНД|Обст.|Ф1 | Ф2 | ПКЛ |t на |Швид. | Лок. | Асім.| Рез.| Лаб. результати | Закл. | Клін.
п/п|ініціали |сть | |(1)|ОПВ |ОПВ |родж.|(3) |ча |(7)| (8) |(9)|(10)|обст.|по- |парал.|парал.|парал.|обст.|-------------------|класиф.|діагн.
| | | | |(2) |(4) |(5) | |ток| | | | |(11) |чатку| (13) | (14) | (15) | (16)| П1 | П2 | П3 |Ент | (19) |(20)
| | | | | | | | |(6)| | | | | | (12)| | | | |(17)|(17)|(17)|(18)| |
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Додаток 6
умовні позначення:
(1) - число доз оральної поліомієлітної вакцини вакцини (ОПВ) згідно з документами про щеплення або за словами батьків;
(2) - число доз ОПВ при додаткових імунізаціях, якщо про це є відомості;
(3) - дати (день/місяць/рік);
(4) - дата останнього щеплення ОПВ;
(5) - дата народження, якщо невідомо, указати вік у роках і міс.;
(7) - дата надання даних (реєстрації) в СЕС;
(8) - дата розслідування випадку;
(9) - дата отримання першої проби фекальних мас;
(10) - дата отримання другої проби фекальних мас;
(11) - дата повторного клінічного обстеження;
(12) - підвищення температури на початку паралічу: 1 = так, 2 = ні, 9 = невідомо;
(13) - швидкий розвиток паралічу (протягом 4 днів): 1 = так, 2 = ні, 9 = невідомо;
(14) - локалізація: 0 = тільки параліч лицевого нерву, 1 = кінцівки, 2 = кінцівки та дихальні м'язи (бульбарний), 3 = тільки бульбарний, 9 = невідомо;
(15) - наявність асиметричного паралічу: 1 = так, 2 = ні, 9 = невідомо;
(16) - огляд через 60 днів: 1 = залишковий параліч, 2 = відсутність паралічу, 3 = втрачено з-під нагляду, 4 = смерть до наступного обстеження;
(17) - ізоляція поліовірусу: 1 = так, "дикий", 2 = так, вакцинний, 3 = так, вірус не типовано, 4 = суміш, "дикий" + вакцинний, 5 = не виділено, 6 = проба не оброблена;
(18) - ізоляція ентеровірусу: 1 = так, 2 = ні, 3 = проба не досліджена;
(19) - заключна класифікація: 0 = не ГВП, 1 = підтверджено, 2 = виключено, 3 = поліомієлітоподібне захворювання, 4 = можливо вакцино-асоційований, 5 = вакциноасоційований;
(20) - заключний клінічний діагноз після 60 днів від початку паралічу: 1 = полірадікулоневрит / синдром Гійєна-Барре /синдром Ландрі/, 2 = поліомієліт, 3 = травматична невропатія, 4 = пухлина, 5 = параліч лицевого нерву, 6 = інше.
Додаток 7
до методичних рекомендацій
Організація епідеміологічного
нагляду за поліомієлітом
Повнота щомісячної інформації про випадки ГВП у дітей
по району/області
(Поставте знак "X" у клітині, що відповідає місяцю, за який
отримано інформацію)
-----------------------------------------------------------------------
|Назва лікува-| Місяці |Всього|
|льного закла-|------------------------------------------------| |
|ду*/району** | І |II |III|IV | V | VI|VII|VII |IX | X | XI|XII| |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+----+---+---+---+---+------|
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+----+---+---+---+---+------|
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+----+---+---+---+---+------|
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+----+---+---+---+---+------|
|Всього отри- | | | | | | | | | | | | | |
|мано (X) | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+----+---+---+---+---+------|
|Всього ліку- | | | | | | | | | | | | | |
|вальних зак- | | | | | | | | | | | | | |
|ладів/районів| | | | | | | | | | | | | |
|(У) | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+----+---+---+---+---+------|
|Повнота | | | | | | | | | | | | | |
|реєстрації | | | | | | | | | | | | | |
|(X/У 100%) | | | | | | | | | | | | | |
-----------------------------------------------------------------------
Підпис відповідальної особи _____________________ Дата ______ * форми, які заповнюються в районних СЕС в останній день місяця; ** форми, які заповнюються в обласних/міських СЕС в перший день наступного місяця.
Додаток 8
до методичних рекомендацій
Організація епідеміологічного
нагляду за поліомієлітом
Своєчасність щомісячної інформації про випадки
ГВП у дітей по району/області
(Поставте знак "X" у клітині, що відповідає місяцю, за який
отримано інформацію)
------------------------------------------------------------------------
|Назва лікува- | Місяці |Всього|
|льного закла- |------------------------------------------------| |
|ду*/району** | І |II |III|IV | V | VI|VII|VII |IX | X | XI|XII| |
|--------------+---+---+---+---+---+---+---+----+---+---+---+---+------|
|--------------+---+---+---+---+---+---+---+----+---+---+---+---+------|
|--------------+---+---+---+---+---+---+---+----+---+---+---+---+------|
|--------------+---+---+---+---+---+---+---+----+---+---+---+---+------|
|Всього отрима-| | | | | | | | | | | | | |
|но вчасно (X) | | | | | | | | | | | | | |
|--------------+---+---+---+---+---+---+---+----+---+---+---+---+------|
|Всього ліку- | | | | | | | | | | | | | |
|вальних зак- | | | | | | | | | | | | | |
|ладів/районів | | | | | | | | | | | | | |
|(У) | | | | | | | | | | | | | |
|--------------+---+---+---+---+---+---+---+----+---+---+---+---+------|
|Показник | | | | | | | | | | | | | |
|реєстрації | | | | | | | | | | | | | |
|(X/У 100%) | | | | | | | | | | | | | |
------------------------------------------------------------------------
Підпис відповідальної особи ___________________ Дата ________
* форми, які заповнюються в районних СЕС в останній день місяця;
** форми, які заповнюються в обласних/міських СЕС в перший день
наступного місяця.
Додаток 9
до методичних рекомендацій
Організація епідеміологічного
нагляду за поліомієлітом
Результати вивчення імунітету до поліомієліту у здорових осіб в
______________ області за ________ рік.
-----------------------------------------------------------------
|Вік об- |Кількість | Число осіб що мають антитела до: |
|стежених|обстеже- | поліовірусу типу 1 |
|(роки) |них осіб | титри |
| | |-------------------------------------------|
| | |нижч|1:4|1:8|1:1 |1:3|1:64|1:12|1:256 |СГТ*|
| | |1:4 | | |6 |2 | |8 |і вище| |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|0 - 3 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|4 - 3 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|7 - 9 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|10 - 12 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|13 - 14 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|15 і ст | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|Всього | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
| % | | | | | | | | | | |
|---------------------------------------------------------------|
| Поліовірусу типу 2 |
|---------------------------------------------------------------|
|0 - 3 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|4 - 3 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|7 - 9 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|10 - 12 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|13 - 14 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|15 і ст | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|Всього | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
| % | | | | | | | | | | |
|---------------------------------------------------------------|
| Поліовірусу типу 3 |
|---------------------------------------------------------------|
|0 - 3 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|4 - 3 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|7 - 9 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|10 - 12 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|13 - 14 | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|15 і ст | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
|Всього | | | | | | | | | | |
|--------+----------+----+---+---+----+---+----+----+------+----|
| % | | | | | | | | | | |
-----------------------------------------------------------------
*СГТ - середні геометричні типи антитіл
Додаток 10
до методичних рекомендацій
Організація епідеміологічного
нагляду за поліомієлітом
Результати виділення ентеровірусів від людей та з об'єктів
довкілля в ___________ області за _______ рік
------------------------------------------------------------------
|Об'єкти| Число | Віруси за типами |
|дослід-| | |
|ження | | |
|-------+----------------------+---------------------------------|
| |обсте-|дослід-|виділе-|Полі-|Ко-|ЕСНО|Інші|Не |Примітка |
| |жених |жених |но |ові- |к- | | |ти-| |
| |осіб |проб |вірусів|ру- |са-| | |по-| |
| | |довкіл-| |си |кі | | |ва-| |
| | |ля | | | | | |ні | |
|-------+------+-------+-------+-----+---------------------------|
| | | | |1|2|3|З зазначенням типів вірусів|
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---------------------------|
|Хворі: | | | | | | | | | | | |
|на | | | | | | | | | | | |
|поліо- | | | | | | | | | | | |
|мієліт | | | | | | | | | | | |
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---+----+----+---+---------|
|ГВП | | | | | | | | | | | |
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---+----+----+---+---------|
|серозні| | | | | | | | | | | |
|менін- | | | | | | | | | | | |
|ти | | | | | | | | | | | |
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---+----+----+---+---------|
|інші | | | | | | | | | | | |
|нейро- | | | | | | | | | | | |
|інфек- | | | | | | | | | | | |
|ції | | | | | | | | | | | |
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---+----+----+---+---------|
|ГРВІ | | | | | | | | | | | |
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---+----+----+---+---------|
|ГКІ | | | | | | | | | | | |
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---+----+----+---+---------|
|інші | | | | | | | | | | | |
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---+----+----+---+---------|
|Здорові| | | | | | | | | | | |
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---+----+----+---+---------|
|Всього | | | | | | | | | | | |
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---+----+----+---+---------|
|Об'єкти| | | | | | | | | | | |
|довкілля | | | | | | | | | | |
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---+----+----+---+---------|
|стічні | | | | | | | | | | | |
|води | | | | | | | | | | | |
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---+----+----+---+---------|
|вода | | | | | | | | | | | |
|відкри-| | | | | | | | | | | |
|тих во-| | | | | | | | | | | |
|доймищ | | | | | | | | | | | |
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---+----+----+---+---------|
|питна | | | | | | | | | | | |
|вода | | | | | | | | | | | |
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---+----+----+---+---------|
|продук-| | | | | | | | | | | |
|ти хар-| | | | | | | | | | | |
|чування| | | | | | | | | | | |
|-------+------+-------+-------+-+-+-+---+----+----+---+---------|
|Всього | | | | | | | | | | | |
------------------------------------------------------------------
Підпис відповідальної особи _________________________________
Затверджено
наказ Міністерства охорони
здоров'я України
від 15.04.1998 р. N 96
Методичні рекомендації
Вірусологічна діагностика поліомієліту
Вірусологічні лабораторії здійснюють моніторинг за циркуляцією вірусів поліомієліту серед населення країни та в об'єктах довкілля. Лабораторні вірусологічні дослідження дають можливість диференціювати випадки паралітичного поліомієліту та гострого в'ялого паралічу (ГВП), що спричинені іншими чинниками, у тому числі і ентеровірусами. Спостереження за циркуляцією поліовірусів в навколишньому середовищі та вивчення рівня колективного імунітету важливі для оцінки епідемічної ситуації з поліомієліту в країні та ефективності профілактичних заходів.
Організація роботи вірусологічних лабораторій
Якісна робота вірусологічних лабораторій можлива за умов стандартизації методів досліджень та забезпечення вірусологічних лабораторій відповідним обладнанням, культурами клітин та середовищами для них, діагностичними препаратами, реактивами тощо. Важливим є використання досвіду вірусологічних лабораторій інших країн, дотримання рекомендацій ВООЗ щодо методики проведення вірусологічних досліджень.
Перелік необхідного обладнання:
Вірусологічний бокс, термостат (33 град. - 38 град.С), СО2 - інкубатор. Для збереження культур клітин і вірусовмісного матеріалу - холодильник побутовий, холодильні камери на 20 град.С, - 40 град.С чи - 70 град.С. Дистилятор, центрифуга, автоклав, сухожарова шафа. Посуд - флакони для культур клітин і взяття матеріалу з корками, що не мають токсичної дії, планшети 96-лункові для культур клітин, рН - метр, світловий мікроскоп, краще інвертований.
І. Культивування та збереження клітинних культур
Культури клітин
При проведенні вірусологічних досліджень необхідно використовувати перещеплювані лінії клітинних культур НЕр-2 та RD, в окремих випадках, як виняток, культури Vero, Rh, Hela, інші чутливі культури людського або мавп'ячого походження. Культура клітин НЕр-2 найбільш чутлива до поліовурусів і вірусів Коксакі В, RD - до вірусів Коксакі А, вірусів поліомієліту і ЕСНО. В кожній лабораторії рекомендується створити банк клітин, в якому клітинні лінії можуть зберігатися певний час без втрати їх життєздатності. Необхідність створення банку пояснюється тим, що чутливість культур клітин до поліо- та інших ентеровірусів при пасажах може знижуватися, не виключається також і можливість їх контамінації. Тому час від часу треба перевіряти чутливість культур до еталонних штамів, вірусів поліомієліту. Небажано проводити більше 20-25 пасажів. Після зазначеної кількості пасажів, зміні чутливості чи у випадку контамінації клітинних ліній необхідно повернутися до банку клітин.
Забезпечення вірусологічних лабораторій культурами клітин НЕр-2 і RD здійснює Українська референс-лабораторія з поліомієліту (УРЛП).
Середовища для культур клітин
Робота з клітинними культурами може бути ефективною тільки за умов дотримання стерильності, якісної обробки посуду та використання поживних середовищ і збалансованих розчинів високої якості. Культивувати клітини можна на середовищах Ігла, Ігла МЕМ, 199 та інших. Якість свіжовиготовлених в лабораторії партій середовищ перевіряють при вивченні ефективності вирощування на них культур клітин, а також шляхом титрування відомого еталонного штаму вірусу в культурах клітин з таким середовищем. При відсутності токсичної дії середовища на клітини і відповідності титру вірусу відомим величинам, середовище використовують для подальших досліджень. Поживні середовища можуть бути ростовими та підтримувальними. Ростові середовища, або середовища росту, містять до 10% сироватки крові великої рогатої худоби чи ембріональної сироватки (сироватки повинні бути інактивовані і кожний флакон перевірений на стерильність та відсутність цитотоксичності). Середовища росту сприяють розмноженню клітин, їх швидкому росту і утворенню добре сформованих моношарів. Для репродукції в культурах клітин вірусів використовують середовища підтримки, які взагалі не містять сироватки, або в кількості не більше 2%. Для успішного культивування клітин необхідно дотримуватися правил асептики, створювати умови, що перешкоджають росту бактерій та цвільових грибів. З цією метою доцільно використовувати антибіотики. Застосовують пеніцилін (натрієва сіль бензилпеніциліну) та стрептоміцин (хлор-кальцієвий комплекс), які вносять в поживні середовища безпосередньо перед вживанням: 100 ОД/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину. Можна використовувати також гентаміцин (200 ОД/мл), канаміцин та лінкоміцин (100 ОД/мл), неоміцин (50 ОД/мл), ністатин (50 ОД/мл) та інші.
Культивування перещеплюваних культур клітин
Перещеплювані клітинні культури вирощують у вигляді моношару на поверхні скла у флаконах, матрацах, пробірках. Для пересівання відбирають культури з чіткими межами між клітинами, що мають типову морфологію. Наявність у полі зору великої кількості округлих клітин, поява клітин з вакуолями та іншими ознаками патології робить дану генерацію непридатною для пересівання. У таких випадках для подальшої роботи використовують клітини з банку. Невелика кількість округлих клітинних елементів, які при незначному струшуванні змиваються з поверхні моношару, не є перешкодою їх використання для вірусологічних досліджень чи для подальшого перещеплювання. Під час росту клітин (після другої - третьої доби) спостерігається зміна рН у кислий бік, при цьому іноді частина клітин відривається від поверхні скла і потрапляє в поживне середовище. Зміна рН в кислий бік, що наступила на першу - другу добу після пасажу клітин та помутніння середовища також можуть бути пов'язані з контамінацією мікроорганізмами. З такою культурою працювати не можна, слід повернутися до банку клітин. Вибрану для пересівання культуру клітин знімають з поверхні скла за допомогою трипсину (0,25%) або версену (0,02%). Після дворазового відмивання моношарів невеликою кількістю розчину трипсину чи версену їх вміщують в термостат на 10-15 хвилин, після чого до клітин додають невелику кількість середовища росту. Ним старанно змивають клітини зі скла. Одержану суспензію клітин після підрахунку в лічільній камері розводять середовищем росту до концентрації, необхідної для посіву. У флакони об'ємом 100 мл розливають по 20 мл суспензії, що містить 40 - 60 тис. клітин в 1 мл, у матраци об'ємом 1,5 л вносять по 150 мл суспензії, в 1 мл якої міститься 60-70 тис. клітин. У пробірки вносять по 180-300 тис. клітин в об'ємі 1 мл. Формування моношару відбувається за 48 год.
З метою запобігання контамінації культури клітинами іншого походження не дозволяється у культурному боксі одночасно працювати більше ніж з однією лінією клітинних культур.
Створення банку клітин
Отримані в Українській референс-лабораторії клітини тричі перещеплюють, заморожують і зберігають при t - 70 град.С, - 40 град.С або в умовах рідкого азоту, дотримуючись правил кріоконсервування.
1. Кріоконсервування (замороження) клітинних культур.
На першому етапі отримують суспензію клітин за допомогою трипсину або версену (див. вище). Далі суспензію центрифугують при 1000 - 2000 об/хв 10 хвилин, зливають надосадову рідину. Ресуспендують клітини в середовищі для заморожування так, щоб кінцева концентрація була не менша за 10 7 клітин/мл. З цією метою можна використовувати 2 типи середовищ для заморожування:
- ростове середовище + 10% ДМСО (диметилсульфоксид)
- ростове середовище + 10% стерильного гліцерину, не
токсичного для клітин.
Клітинну суспензію розливають по 1 мл в пробірки для заморожування з кришками, що загвинчуються, або в ампули, відмічають дату, тип клітин, номер пасажу та прізвище відповідальної особи. Пробірки вміщують у пенопластові контейнери, які дозволяють охолоджувати клітини з постійною швидкістю і зберігають в холодильнику при -70 град.С. Термін збереження життєздатності культур клітин при -70 град.С складає близько року, іноді й більше, хоча частина популяції клітин при цьому втрачає життєздатність. При -40 град.С можна зберігати клітини протягом 0,5 року. В рідкому азоті час зберігання клітин необмежений.
2. Поновлення заморожених культур клітин
Пробірку із замороженими клітинами вміщують у полиетиленовий пакет і швидко розморожують у водяній бані при 36 град.С протягом 3-х хвилин. Після цього протирають поверхню пробірки 70% етанолом, обережно відкривають пробірку в боксі. Для зменшення токсичної дії консервантів (ДМСО чи гліцерину) в пробірку з клітинною суспензією поступово по краплям додають 1-2 мл поживного середовища, постійно - струшуючи вміст пробірки. Після цього негайно центрифугують клітини при 1000-2000 об/хв протягом 3-4 хвилин. Зливають надосадову рідину, яка містить консервант. Відмиті клітини ресуспендують в середовищі росту до кінцевої концентраціі 40 - 60 тис. клітин/мл і заливають в порожній посуд, що призначений для культивування культур (флакон, матрац). Наступного дня, коли клітини починають формувати моношар, перевіряють їх якість і замінюють середовище росту на свіже, щоб видалити залишки консерванту і нежиттєздатні клітини.
II. Титрування вірусів у культурах клітин
Титрування вірусів у культурах клітин за цитопатичною дією (ЦПД)
Метод титрування вірусу за ЦПД грунтується на визначенні найбільшого розведення вірусвмісного матеріалу, в якому вірус може спричинити ЦПД у 50% інфікованих культур клітин. Ця величина називається 50% тканинною цитопатогенною дозою (ТЦД50).
Для титрування вірусів спочатку проводять звільнення внутриклітинного вірусу і очищення вірусвмісного матеріалу від клітинного детриту шляхом його заморожування та розморожування з подальшим центрифугуванням при 1000 - 2000 об/хв протягом 3-5 хв.
Для інфікування культур клітин готують десятиразові розведення досліджуваного вірусвмісного матеріалу, використовуючи стерильні сольові розчини (фізіологічний розчин, розчин Хенкса тощо). Розведення краще готувати в стерильних флаконах від пенициліну. Для отримання кожного наступного розведення слід міняти піпетки (наприклад, стерильною кінцевою піпеткою вносять у першу пробірку 1,8 мл сольового розчину і 0,2 мл вірусвмісного матеріалу - отримали розведення 10-1; другою стерильною піпеткою перемішують рідину і переносять 0,2 мл до другої пробірки - отримали розведення 10-2 і так далі).
Титрування здійснюють у чутливих культурах клітин, які сформували за добу добрий моношар на стінці пробірок або флаконів від пеніцілину. З пробірок чи флаконів з культурою клітин видаляють середовище росту і вносять по 0,1 мл вірусвмісного матеріалу на пробірку (0,2 мл на флакон). На кожне розведення вірусу використорують 4 пробірки (флакони) з культурою клітин. Починають інфікування культур з кінцевого розведення вірусу, у цьому разі зникає потреба щоразу міняти піпетки. Потім до кожного моношару клітин додають середовище підтримки. Інфіковані та контрольні культури вміщують у термостат і витримують при температурі 36 град.С. Результати визначають на 3 - 5 добу. Інтенсивність ЦПД оцінюють за системою плюсів (4+). Далі проводиться статистична обробка за методом Ріда-Менча або за формулою Кербера. Визначається ТЦД50 в об'ємі матеріалу, взятого для зараження одного моношару з культурою клітин. Роблять перерахунок по визначеню ТЦД50 на 1 мл вірусвмісного матеріалу.
Формула Кербера для визначення титру вірусу:
lg ТЦД50 = L - d(S-0,5), де
L - lg найменшого розведення, яке використане у титруванні;
d - інтервал у lg між двома послідовними розведеннями;
S - сума пропорцій позитивних тест-одиниць (тобто пробірок з культурою, де з'явилася ЦПД) у кожному розведенні.
Приклад:
-----------------------------------------------------------------
Розведення вірусу | Пропорція культур, в яких виявлено ЦПД
-------------------+---------------------------------------------
10-1 | 4/4=1
10-2 | 4/4=1
10-3 | 4/4=1
10-4 | 2/4=0,5
10-5 | 1/4=0,25
10-6 | 0/4=0
10-7 | 0/4=0
10-8 | 0/4=0
-----------------------------------------------------------------
lg ЦД50= -1-1(3,75-0,5)=-4,25
Титр вірусу = 10 4,25/0,1 мл
У деяких випадках замість 4-х пробірок на одне розведення вірусу припустимо використання лише 2-х пробірок, при цьому точність підрахунків дещо знижується, хоча й залишається достатньою для подальших досліджень.
Титрування вірусів у культурі клітин за методом бляшкоутворення під бентонітовим покриттям
Цей метод грунтується на здатності цитопатогенних вірусів до локального руйнування клітинного моношару, покритого поживним середовищем, що містить бентоніт. Вірусна бляшка є наслідком деструкції клітин потомством однієї вірусної частки. Бляшки вірусів мають вигляд округлих прозорих плям на неушкодженому фоні моношару, покритому бентоніном. Феномен бляшкоутворення отримують таким чином: вірусвмісним матеріалом інфікують чутливі перещеплювані культури клітин, що вирощені в невеликих матрацах, на дні колбочок Ерленмейера або флаконів з-під пенициліну об'ємом 10-20 мл. Після адсорбції вірусів (через 30-40 хв.) інфіковані моношари заливають поживним середовищем, що містить гель бентоніту. Під шаром бентоніту в поживному середовищі клітини зберігають життєздатність протягом 4-6 діб. Через 1,5-2 доби після інфікування з'являються вірусні бляшки. Інфекційність вірусів виражають в бляшкоутворючих одиницях (БУО/мл). Для одержання ефекту бляшкоутворення доцільно використовувати ті самі клітинні культури, що й для виділення вірусів - негусті моношари 1-2 добового формуання.
Склад поживного середовища з гелем бентоніту для виявлення вірусних бляшок:
Бідистильована вода, мл 415
Гель бентоніту 5%, мл 5
Розчин Ерла, 10-кратний, мл 50
Нативна бичача сироватка крові, мл 15
Розчин натрію гідрокарбонату 7,5%, мл 15
Пеніцилін, ОД/мл 200
Стрептоміцин, мкг/мл 100
Приготування середовища покриття з гелем бентоніту
До стерильної бідистильовакої води у флаконі об'ємом 500 мл додають 5 мл гелю бентоніту. Суміш інтенсивно струшують, щоб одержати дрібнодисперсну суспензію часток сорбенту. Потім послідовно додають вищезгадані компоненти. Замість 10-кратного розчину Ерла можна використовувати однократний. У такому випадку згадані компоненти, за винятком бідистильованої води, додають безпосередньо до цього розчину. Важливо старанно диспергувати бентоніт в розчині Ерла шляхом інтенсивного струшування. Оптимальні значення рН бентонітового покриття 8,0 - 8,2.
Методика титрування вірусів за бляшкоутворенням
Вірусовмісний матеріал розводять десятиразово у стерильному сольовому розчині. Відбирають флакони із сформованим моношаром клітинних культур, видаляють з них поживне середовище і вносять на моношари флаконів від пеніциліну або колбочок Ерленмейєра відповідно по 0,2 та 0,5 мл матеріалу кожного розведення, починаючи з найвищого. Рівномірно розподіляють вірусовмісний матеріал по поверхні моношару. Адсорбція вірусів на клітинах відбувається при температурі 36 град.С протягом 30 - 40 хвилин. Після цього моношари відмивають стерильним сольовим розчином і вносять поживне середовище з бентонітом в об'ємі 3-5 мл для моношарів клітин, що вирощені на дні флаконів від пеніциліну, і 10-15 мл для невеликих матрасів або колбочок Ерленмейєра на 50 мл. Інфіковані флакони витримують при температурі 36 град.С. Облік здійснюють через 48 годин. Титр вірусу обчислюють в БУО/мл вірусвмісного матеріалу. В таблиці 1 наведений приклад розрахунку титру вірусу в БУО/0,2 мл (використовували флакони від пеніциліну з моношарами клітин, на кожний моношар вносили по 0,2 мл розведеного вірусу).
Таблиця 1.
Приклад розрахунку титру вірусу
------------------------------------------------------------------
Розведення | Кількість ви- | Кількість утво- | Усереднені титри
вірусу | користаних | рених бляшок | вірусу
| моношарів | | (БУО/0,2 мл)
------------------------------------------------------------------
10 -4 2 34; 30 3,2х10 5
10 -5 2 4; 6 5,0х10 5
10 -6 2 0; 1 5,0х10 5
------------------------------------------------------------------
Визначають середню арифметичну величину від усереднених титрів для всіх розведень з урахуванням об'єму досліджуваної рідини, яку вносили на моношар.
(3,2+5,0+5,0)/3х5х10 5 = 2,2х10 6 БУО/мл,
де 5 - коефіцієнт перерахунку об'єму на 1 мл,
10 5 - розведення вірусу,
3 - кількість спостережень,
(3,2+5,0+5,0) - усереднена кількість бляшок при екстраполяції на однакове розведення (10 -5).
III. Ідентифікація ізольованих штамів ентеровірусів
Ідентифікація ентеровірусів у реакції віруснейтралізації по пригніченню цитопатогенної дії.
Реакція нейтралізацій (РН) грунтується на властивостях імунної сироватки блокувати здатність вірусу репродукуватися в культурі клітин і не викликати ЦПД чи утворення бляшок. Це є наслідком взаємодії нейтралізуючих антитіл з поверхневими антигенами віріону, що відповідають за його адсорбцію на клітині. За певних умов віруснейтралізуючі антитіла здатні також руйнувати віріони. РН може бути застосована як для ідентифікації виділених ентеровірусів, так і для виявлення рівня антитіл у сироватці людини.
Ідентифікація виділених з клінічного матеріалу ентеровірусів здійснюється в реакції нейтралізації з використанням відомих діагностичних ентеровірусних імунних сироваток. Тип вірусу визначають по типу сироватки, що його нейтралізувала. Для реакції нейтралізації використовують стандартні комерційні набори діагностичних полі- та моновалентних сироваток. При проведенні реакції беруть однакові об'єми дози вірусу (100 ТЦД50) і діагностичної сироватки, у робочому розведенні якої не менше 20 нейтралізуючих одиниць. Підготовку сироваток та ідентифікацію вірусів слід проводити згідно з інструкцією, що додається до набору.
Через те, що рід ентеровірусів представлено значною кількістю серологічних типів, доцільно під час типування використовувати суміш діагностичних сироваток проти різних типів вірусів поліомієліту, Коксакі та ЕСНО (схема Лім, Беньяш-Мельник). У таблиці 2 наведено склад сумішей для типування 42 типів ентеровірусів.
Таблиця 2. Склад сумішей імунних сироваток для типування
ентеровірусів.
------------------------------------------------------------------
Суміш | Імунні сироватки для серотипів вірусів
-------+----------------------------------------------------------
|Поліомієліту|Коксакі В|Коксакі А| ЕСНО
-------+------------+---------+---------+-------------------------
А | - | 1,4 | 7 |1, 4, 5, 7, 15, 22, 33
-------+------------+---------+---------+-------------------------
В | 2 | 2 | 7,9 |2, 3, 9, 19, 21, 26
-------+------------+---------+---------+-------------------------
С | 1 | 1, 3, 5 | - |2, 6, 12, 24, 29, 30
-------+------------+---------+---------+-------------------------
D | 3 | 2 | - |6,13,14,16,25,26,32,33
-------+------------+---------+---------+-------------------------
Е | 2 | 4,5 | - |5, 11, 13, 17,18,22,30,32
-------+------------+---------+---------+-------------------------
F | 1 | 6 | - |7, 9,14,18,19,20,26,27,29
-------+------------+---------+---------+-------------------------
G | - | 3 | 9 |4, 16, 17, 20, 23, 30, 31
-------+------------+---------+---------+-------------------------
Н | 3 | 6 | 16 | 1, 3, 9, 12, 22, 23, 32
------------------------------------------------------------------
Якщо штам вірусу цими сумішами не нейтралізується, проводять РН з імунними сироватками до інших ентеровірусів. Робочі розведення виділеного штаму ентеровірусів готують, виходячи з його титру, таким чином, щоб у 0,1 мл кінцевого розведення містилося 100 ТЦД50 (або 100 БУО) вірусу. Кількісне співвідношення інгредієнтів для розведення вірусвмісного матеріалу наведено в табл. 3.
Таблиця 3. Співвідношення інгредієнтів для розведення
вірусомісного матеріалу.
-----------------------------------------------------------------
Логарифм | Об'єм мате- | Об'єм | Кратність
розведення | ріалу, що | розрід- | розведення
вірусвмісного| розводиться | жувача,мл |
матеріалу | | |
--------------+-------------+-----------+------------------------
0,2 | 1,0 | 0,6 | 1,6
0,3 | 1,0 | 1,0 | 2,0
0,4 | 1,0 | 1,5 | 2,5
0,5 | 1,0 | 2,2 | 3,2
0,6 | 1,0 | 3,0 | 4,0
0,7 | 0,5 | 2,0 | 5,0
0,8 | 0,5 | 2,75 | 6,4
0,9 | 0,5 | 3,5 | 8,0
1,0 | 0,5 | 4,5 | 10,0
-----------------------------------------------------------------
Наприклад. Вихідний титр вірусу 10 6,3 ТЦД50/мл, або 10 5,3 ТЦД50/0,1 мл. Доза, необхідна для РН (1000 ТЦД50/0,1 мл), міститься у розведенні 10 -3,3. Готують три послідовних 10- кратних розведення, останнє з яких розводять ще двічі, оскільки антилогарифм 0,3=2.
Розведення діагностичних імунних сироваток та приготування їх сумішей здійснюють згідно з інструкцією, до кінцевої концентрації 20 нейтралізуючих одиниць (тобто у 20 разів більше, ніж треба для нейтралізації 100 ТЦД50 вірусу) кожної сироватки. У цьому разі враховують вихідний титр сироватки або її робоче розведення, зазначені на етикетці ампули.
Для постановки РН готують нейтралізаційні суміші, до складу яких входять рівні об'єми вірусвмісного матеріалу в робочому розведенні (100 ТЦД50 вірусу в 0,1 мл) і сироватки кожного типу (чи сумішей діагностичних сироваток). Нейтралізаційні суміші витримують протягом години при температурі 36 град.С, вносять по 0,2 мл кожної суміші (0,1 мл вірусу+0,1 мл сироватки) в 4 пробірки (флакони) з 24-48 годинною моношаровою культурою клітин. Через 40 - 60 хвилин інкубації при 36 град.С додають середовище підтримки в певному об'ємі (в залежності від площі моношарів). Паралельно ставлять контролі:
- дози вірусу для визначення фактичноі кількості ТЦД50, що бере участь у реакції: моношари клітин інфікують робочим розведенням, а також розведеннями, які містять 10 ТЦД50 та 1000 ТЦД50;
- робочого розведення сумішей діагностичних сироваток з метою виявлення можливої неспецифічної цитопатичної дії;
- культури клітин.
Пробірки (флакони) розміщують в термостаті при 36 град.С і ведуть спостереження, починаючи з другого дня, протягом 3-5 діб. Облік результатів РН проводять, починаючи з оцінки стану контролів, які повинні бути такими: моношари неінфікованих культур залишаються незміненими до кінця експерименту (контроль клітин); типоспецифічні імунні сироватки (суміші) не спричиняють цитотоксичної дії, (контроль сироваток), робоча доза вірусу визначена вірно.
Тип виділеного вірусу визначається за спільним компонентом імунних сироваток, що входять до складу сумішей, які нейтралізують його інфекційну активність (табл. 4).
Таблиця 4. Визначення типу ентеровірусів за результатами
реакції нейтралізації.
------------------------------------------------------------------
Нейтралізація | Ідентифікова | Нейтраліза- | Ідентифікований
сумішшю | ний штам ен- | ція сумішшю | штам ентеровіру-
імунних сиро- | теровірусу | імунних си- | су
ваток | | роваток |
----------------+--------------+-------------+--------------------
А | ЕСНО-15 | CD | ЕСНО-6
В | ЕСНО-21 | СЕ | Коксакі В-5
С | ЕСНО-24 | CF | Поліо-1
D | ЕСНО-25 | CG | Коксакі В-3
Е | ЕСНО-11 | СН | ЕСНО-12
F | ЕСНО-27 | DE | ЕСНО-13
G | ЕСНО-31 | DF | ЕСНО-14
Н | Коксакі А-16 | DG | ЕСНО-16
АВ | Коксакі А-7 | DH | Поліо-3
АС | Коксакі В-1 | EF | ЕСНО-18
AD | ЕСНО-33 | EG | ЕСНО-17
АЕ | Коксакі В-4 | ЕН | ЕСНО-22
AF | ЕСНО-7 | FG | ЕСНО-20
AG | ЕСНО-4 | FH | Коксакі В-6
АН | ЕСНО-1 | GH | ЕСНО-23
ВС | ЕСНО-2 | ACF | ЕСНО-29
BD | Коксакі В-2 | AEG | ЕСНО-5
ВЕ | Поліо-2 | BDP | ЕСНО-26
BF | ЕСНО-19 | BFH | ЕСНО-9
BG | Коксакі А-9 | CEG | ЕСНО-30
ВН | ЕСНО-3 | DEH | ЕСНО-32
------------------------------------------------------------------
Наприклад. Виділений цитопатичний вірусний штам нейтралізується сумішами В і Е. До складу сумішей входять імунні сироватки до таких типів ентеровірусів:
------------------------------------------------------------------ Суміш В | Суміш Е --------------------------+--------------------------------------- Поліо-2 | Поліо-2 Коксакі А-7, А-9, В-2 | Коксакі В-4, -5 ЕСНО -2, -3, -9, -19, | ЕСНО -5, -11, -13, -17, -18, -22, -21, -26 | -30, -32 ------------------------------------------------------------------
Нейтралізація досліджуваного вірусу одночасно двома сумішами В і Е дає змогу зробити висновок, що досліджуваний вірус є вірусом поліомієліту 2 типу (табл. 4).
Інколи для ідентифікації вірусу, виділеного з матеріалу від хворого з підозрою на ентеровірусну інфекцію, реакцію нейтралізації можна проводити в два етапи: замість 8 сумішей імунних сироваток (табл. 2) можна використовувати полівалентні поліо-, Коксакі А,В та ЕСНО антивірусні сироватки. У разі нейтралізації вірусу однією з цих сумішей проводять нейтралізацію з використанням монорецепторних поліо-, Коксакі-, або ЕСНО- антивірусних сироваток.
Ідентифікація ентеровірусів у реакції віруснейтралізації за редукцією бляшкоутворення під бентонітовим покриттям
Постановка РН проводиться з використанням тих самих ентеровірусних діагностичних сироваток, що і для РН За пригніченям ЦПД. Суть методу полягає в поєднанні виділеного вірусу з відповідною кількістю типоспецифічної діагностичної сироватки (чи суміші) і спостереженні за редукцією бляшок під бентонітовим поживним покриттям. Про відповідність штаму вірусу одній із сироваток свідчить пригнічення репродукції вірусу і, відповідно, відсутність бляшок на моношарі клітин.
Для постановки РН за редукцією бляшкоутворення під бентонітовим покриттям використовують виділені штами вірусів у робочій дозі 50-100 БУО в 0,1 мл. Суміші діагностичних сироваток (склад сумішей див. табл. 1), готують так, щоб у кінцевому розведенні в 0,1 мл містилося не менше, як 20 віруснейтралізуючих одиниць кожної сироватки.
У пробірці поєднують однакові об'єми однієї із сумішей діагностичних імунних сироваток і робочого розведення вірусу, інтенсивно струшують і витримують в термостаті при 36 град.С протягом 1 год. Такою сумішшю інфікують моношари (по 2-4 моношари на кожну суміш). Бажано використовувати ту культуру клітин, на якій було виділено даний штам вірусу. Через 40-60 хвилин контакту суміші з моношарами (період адсорбції вірусу) флакони заливають бентонітовим поживним покриттям (3-4 мл на флакон від пеніциліну). Паралельно контролють сироватки на цитотоксичність і робочу дозу вірусу. Результати РН оцінюють через 36-48 год. інкубації в термостаті при 36 град.С. При позитивних результатах РН відмічається відсутність бляшок або зниження їх кількості на 80% у порівнянні з контролем вірусу (50-100 БУО/0,1 мл). Тип вірусу визначається по табл. 4.
Ідентифікація штамів поліо- та інших ентеровірусів за альтернативним методом (мікрометод, рекомендований ВООЗ)
Постановка реакції здійснюється в спеціальних 96-луночкових мікроплатах для культур клітин з плоским денцем. Для постановки реакції віруснейтралізації можна користуватися тими самими діагностичними сироватками, що і для постановки реакції макрометодом в пробірках, флаконах. Використовують середовище, яке містить 2% ембріональної сироватки, культури клітин НЕр-2, RD. Готують розведення діагностичних сироваток згідно з доданим настановленням і вносять по 50 мкл кожної сироватки (суміші) в 4 лунки. Паралельно здійснюють контрольне титрування вірусу (визначення титру вірусу). Для цього готують серії десятиразових розведень вірусу від 10 -1 до 10 -7 в об'ємі 1 мл (0,9 мл середовища+0,1 мл вірусу) за винятком розведень 10 -3 і 10 -4, де об'єм повинен становити 2,0 мл (1,8 мл середовища + 0,2 мл попереднього розведення вірусу). Для контрольного титрування використовують розведення від 10 -7 до 10 -3, для досліду беруть по 50 мкл кожного 40 розведення у 4 повторах. Титр вірусу визначають за Ридом-Менчем або а Кербером (див. вище).
Для постановки реакції віруснейтралізації використовують розведення 10 -3 та 10 -4 (близько 100 ЦПД50 в 50 мкл): у дві лунки з відповідною сироваткою чи сумішшю сироваток додають по 50 мкл розведення 10 -3, а у дві інші - 50 мкл розведення 10 -4. У 4 лунки для контролю клітин вносять по 100 мкл середовища. В усі лунки контрольного титрування також додають по 50 мкл середовища. Загальний об'єм у всіх лунках повинен бути однаковим.
Мікроплату закривають кришкою і інкубують при 36 град.С протягом 1 години. Після цього в усі лунки додають по 100 мкл суспензії клітин (НЕр-2, RD), що містять 150000 клітин в 1 мл, заклеюють плату спеціальною плівкою, і інкубують її в СО2-інкубаторі при 36 град.С. Мікроскопують за допомогою інвертованого мікроскопу і записують результати щоденно, облік результатів закінчують через 24 години після виявлення 100% ЦПД у лунках контролю вірусу. Якщо титр вірусу дорівнює 10 4,5 - 10 6,5 ТЦД50 (тобто 100 ТЦДЦ50 + - 0,5 lg в 50 мкл, що відповідає робочій дозі вірусу 10 -3 - 10 -4), то можна оцінювати реакцію віруснейтралізації. Якщо титр вірусу менший або більший необхідно повторити типування з правильно підібраною дозою вірусу.
IV. Серологічні методи дослідження
(виявлення антитіл до поліовірусів у сироватці крові)
Серологічні методи дослідження проводяться з метою визначення рівня антитіл до поліовірусів у сироватках крові хворих або для оцінки стану популяційного імунітету населення до поліомієліту. Виявлення сероконверсії (приросту титру антитіл в 4 і більше рази) в сироватці хворого є додатковим підтвердженням діагнозу захворювання з урахуванням комплексу клінічних, вірусологічних та епідеміологічних даних. Для виявлення сероконверсії використовують парні сироватки, першу з яких бажано взяти на 2-4 добу хвороби, другу - через 2-3 тижня. При необхідності досліджують і третю сироватку крові. Для визначення рівня гуморального імунітету відбирають тільки одну сироватку. Для отримання сироватки бажано відібрати 3-5 мл крові. Пробірку з кров'ю залишають на 2 години при кімнатній температурі. Утворений згусток відокремлюють від стінок пробірки стерильною скляною паличкою або пастерівською піпеткою. Прискорення ретракції згустка крові та збільшення виходу сироватки відбувається, якщо далі кров витримують у холодильнику при температурі 0 - +8 град.С протягом 18-24 год. Відокремлену від згустка сироватку центрифугують протягом 10 хв. при 1500 об/хв для видалення рештки домішок клітин крові. Частину сироватки досліджують, решту зберігають у замороженому стані.
Якщо досліджуються парні сироватки, то першу сироватку зберігають до моменту отримання другої. В подальшому їх досліджують одномоментно.
Якщо у дитини неможливо взяти кров із вени, її можна отримати із пальця. Мінімальна кількість сироватки, що не необхідна для дослідження, становить 0,1 мл. З пальця можна одержати 0,3-0,4 мл крові, яку збирають у невеличку стерильну ємкість, без антикоагулянтів або консервантів. Сироватку від згустка відокремлюють, як позначено вище.
Як вже відмічалось, РН грунтується на специфічній взаємодії антитіл сироватки хворого чи вакцинованої особи з еталонним вакцинним або аутоштамом поліовірусів з наступною нейтралізацією інфекційної активності вірусу (відсутність ЦПД чи бляшок при відповідних контролях).
При постановці РН з метою серологічної діагностики беруть постійну дозу вірусу (100 ТЦД50 або 100 БУО в 0,1 мл) і послідовні 2-разові розведення досліджуваних сироваток крові.
Дослідження необхідно проводити з вакцинними штамами вірусу поліомієліту типів 1, 2 та 3, які можна одержати в Українській референс-лабораторії з поліомієліту. Проведення реакції з використанням еталонних вірулентних штамів поліовірусу суворо забороняється.
Еталонні вакцинні штами напередодні постановки РН титрують на тих клітинах і за такою ж методикою, як далі буде проводитись постановка РН.
Методика постановки РН з метою серологічної діагностики поліомієліту за пригніченням ЦПД
Для звільнення сироваток крові від термолабільних інгібіторів їх прогрівають при 56 град.С протягом 30 хв (слід враховувати, що така теплова обробка призводить до зменшення титру антитіл класу IgM). Потім готують розведення парних сироваток крові з 2-кратним інтервалом від 1:4 до 1:512-1:1024, і кожне розведення, починаючи з останнього, після ретельного перемішування вносять по 0,4 мл у 3 простерилізовані пробірки. У пробірки з розведеннями сироваток додають по 0,4 мл розведення вакцинного штаму поліовірусу відповідного типу, що містить 100 ТЦД50. Суміші вірусів з різними розведеннями сироватки крові струшують і витримують при температурі 36 град.С протягом 1 год.
Кожну суміш вносять по 0,2 мл у 2-4 пробірки (флакони) з 24- 48 - годинною моношаровою культурою чутливих клітин, попередньо видаливши з неї середовище росту. (При недостатній кількості сироватки крові нейтралізацію з вірусом кожного типу ставлять в одному ряді розведень.) Інфіковані моношари інкубують при 36 град.С протягом 30-60 хвилин, після цього заливають середовище підтримки.
Паралельно ставлять контролі:
1) Контроль дози вірусу для визначення фактичної кількості ТЦД50, що бере участь у реакції: по 4 пробірки з моношаром клітин інфікують вірусом, взятим у робочому розведенні (100 ТЦД50 у 0,1 мл), а також у трьох зменшених розведеннях, які містять 10 ТЦД50, 1 ТЦД50, 0,1 ТЦД50 вірусу.
2) Контроль сироваток на цитотоксичність: 0,1 мл найменшого розведення (1:4) кожної сироватки крові наносять на моношар з культурою клітин.
3) Контроль культури клітин - для виявлення можливої неспецифічної ЦПД. Для цього залишають незараженими 4 моношари культур клітин, які інкубують при температурі 36 град.С протягом 5-7 діб.
РН за редукцією вірусних бляшок здійснюється за такою ж методикою, з використанням чутливих культур клітин, що виросли на дні флаконів від пеніциліну, та бентонітового покриття.
Враховують результати РН, починаючи з контролів. Потім оцінюють результати в дослідних пробірках чи флаконах. Затримка ЦПД вірусу свідчить про наявність антитіл у сироватці крові. В РН по редукції бляшкоутворення позитивним вважається результат, коли спостерігається повна відсутність чи зниження на 80% кількості бляшок при повноцінному контролі вірусу (5-100 бляшок). Діагностичне значення має 4-разове зростання титру антитіл у другій сироватці.
Серологічні дослідження можуть надати допомогу при підтвердженні діагнозу поліомієліту, але згідно з рекомендаціями ВООЗ їх не можна вважати головним діагностичним критерієм. Ці дослідження не дозволяють відрізнити інфікування диким поліовірусом від нормальної реакції на вакцинацію проти поліомієліту. Особливе значення серологічні дослідження мають для оцінки стану колективного імунітету до поліовірусів.
V. Вірусологічна діагностика поліомієліту та інших
ентеровірусних інфекцій
Взяття і доставка матеріалу
Лабораторну діагностику поліомієліту необхідно проводити шляхом виділення вірусів з фекальних проб хворого з використанням культури клітин. Забір проб необхідно проводити якомога швидше - в перші 14 діб (а краще протягом перших днів) після появи паралічів. У цей період кількість вірусів у фекальних масах досягає найвищих рівнів. У зв'язку з тим, що виділення вірусів з фекальних мас не носить постійного характеру, проби треба відбирати двічі: перша проба - в день обстеження хворого, друга проба - через 24-48 годин після забору першої проби.
Змиви з ротоглотки менш ефективні для виділення поліовірусів (лише у перші 7-10 днів після початку хвороби). Незважаючи на нейротропізм поліовірусів, вони рідко виділяються із спинномозкової рідини, у той час, як інші ентеровіруси можуть бути ізольовані з ліквору з високою частотою. Усі проби для виділення вірусів повинні бути взяті у найбільш ранні терміни після початку захворювання. У летальних випадках секційні проби слід взяти у перші години після смерті.
Усі проби для виділення вірусу необхідно брати дуже обережно, щоб виключити можливість контамінації однієї проби вірусом з іншої проби.
В осередку інфекції відбирають по одній пробі фекальних мас від кожного з 5 контактних дітей віком до 5 років. Доцільно обстежувати осіб, які могли спілкувались з хворим: друзів по дитячим іграм, однокласників, братів та сестер. Збір матеріалу від осіб що спілкувалися і у випадках, коли від початку паралічу пройшло більше 6 тижнів, але матеріал не було зібрано, а також у випадках смерті хворого. Якщо від початку паралічу пройшло більше 3 місяців, досліджувати матеріал від осіб, що спілкувалися з хворим, недоцільно.
Для вірусологічних досліджень збирають проби фекальних мас вагою 8-10 грамів. Ця кількість матеріалу дозволить при необхідності провести повторні дослідження. Проби розміщують у спеціальних контейнерах з кришками, що загвинчуються, чи іншому стерильному посуді (скляному або пластмасовому). На пробі вказують прізвище пацієнта, реєстраційний номер випадку, дату взяття матеріалу. Пробу відразу ж вміщують у холодильник з температурою 0-+8 град.С. На кожного обстеженого оформлюється направлення на лабораторне дослідження, яке повинно знаходитись окремо від проби (додаток 1). Його не слід обгортати навколо проб чи класти у холодильник.
Для транспортування проби треба загорнути у гігроскопічний матеріал, запакувати у пластиковий пакет і розмістити в контейнері з термоізоляційним шаром і холодовими елементами. Усі бланки з даними, що мають відношення до проб, треба покласти в конверт, зазначити на ньому дату б відправлення, помістити в окремий поліетиленовий пакет і покласти в контейнер.
Якщо очікується, що період часу між взяттям проби та її дослідженням у лабораторії перевищить 72 год., пробу необхідно тримати в морозильній камері при температурі -20 град.С. У такому випадку проби направляють в лабораторію замороженими з використанням холодових елементів чи з сухим льодом, що носить назву "зротнього холодового ланцюга". Якщо його не дотримуватися протягом усього часу транспортування, поліо- та інші ентеровіруси, що знаходяться в фекаліях, можуть інактивуватися. При транспортуванні зразків фекалій потрібно використовувати термоконтейнери, сумки та холодові елементи, що призначені тільки для клінічного матеріалу, вони ні в якому разі не можуть бути використані для вакцини.
Лабораторію, до якої надсилають зразки, повинно бути попереджено про надходження матеріалу. У летальних випадках відбирають секційний матеріал - сегмент низхідної товстої кишки довжиною 3-5 см разом з вмістом, шматочки тканин з шийного та поперекового відділів спинного мозку, довгастого мозку, варолієвого моста (приблизно по 1 см3). Матеріал заливають середовищем для транспортування вірусів. Це середовище складається з основного сольового розчину Хенкса, розведеного до рН 7,4 буфером HEPES, з 0,2% бичачого альбуміну. До середовища додають антибіотики - пеніцилін і стрептоміцин (або гентаміцин) і феноловий червоний, як індикатор. Середовище розливають по 2,5 мл у герметично закриті флакони і зберігають при 0-+8 град.С. Концентрований розчин гентаміцину (1 г гентаміцину сульфату в 200 мл стерильного фосфатного сольового буферу) розливають по 5 мл і зберігають при -20 град.С. Для використання додають 1 мл цього розчину до 100 мл середовищ, щоб кінцева концентрація дорівнювала 30-50 мкг/мл.
Додатково можна використовувати інші антибіотики: мікостатин фунгіцидної дії (25 ОД/мл), канаміцин та інші.
Підготовка матеріалу до вірусологічних досліджень
Половину зразку фекальних мас залишають при -20 град.С як резерв, необхідний для повторного вірусологічного дослідження. Другу половину використовують для виділення ентеровірусів, попередньо підготувавши суспензію освітлених фекальних мас. З цією метою ВООЗ рекомендує використовувати хлороформ. До флакону з керамічними (скляними) кульками додають 10 мл ФБР (фосфатно-буферного розчину). За допомогою шприця вносять 0,5 мл хлороформу і шпателем - 2 г фекалій, щоб отримати 20% суспензію. Флакон енергійно струшують протягом 20 хв. та центрифугують 20 хв. при 1500-3000 об/хв. Переносять по 3-4 мл освітленої фекальної суспензії в 2 пробірки. Проби підписують і нумерують. Одну використовують для виділення вірусів, другу зберігають як запасну при -20 град.С. Для отримання суспензії освітлених фекальних мас, можна використовувати і ефір за загальновживаною методикою.
Виділення і ідентифікація ентеровірусів
Паралельно інфікують по 2 пробірки з моношаром клітинних ліній НЕр-2 та RD) (по 0,2 мл суспензії на кожну пробірку). По 2 пробірки з кожною лінією клітин залишають як контроль клітинних культур. Інкубують при 36 град.С. Моношар клітин мікроскопують щоденно, записуючи результати мікроскопування (цитопатогенну дію, яка може спричинятися як ентеровірусами, так і бути результатом токсичної дії фекальних мас на клітини). Проби, що викликали ЦПД у культурі клітин, заморожують при -20 град.С і розморожують, центрифугують, відбирають супернатант, який використовують для наступного пасажу з метою запобігання токсичній дії фекалій до початку серотипування. З матеріалом, що не дав ЦПД, або якщо після зараження фекальною суспензією клітини проявляють швидку (менш, ніж за 24 години) дегенерацію через токсичність фекалій, необхідно зробити додаткові пасажі.
Після виявлення цитопатогенного агенту проводять титрацію вірусів та ідентифікацію їх в реакції віруснейтралізації згідно з методиками, що описані вище. Термін дослідження клінічного матеріалу у вірусологічних лабораторіях областей 28 діб.
Усі поліовіруси та інші ентеровіруси, виділені з клінічного матеріалу та об'єктів довкілля, протягом 7 діб після їх виділення та ідентифікації повинні бути нарочним доставлені до УРЛП для підтвердження правильності типування і наступного проведення внутрішньотипової диференціації. Щоквартально обласні лабораторії надсилають звіти до УРЛП за формами, що надаються (додаток 2).
VI. Вірусологічні дослідження об'єктів
навколишнього середовища
Первинне розмноження ентеровірусів відбувається в ентероцитах тонкої кишки, звідки вони з фекальними масами потрапляють до довкілля, забруднюють грунт, воду, можливе їх надходження до молочних продуктів, овочів і фруктів. Значне накопичення ентеровірусів, включаючи поліовіруси, відбувається в тканинах молюсків, що фільтрують воду (устриці, мідії тощо).
Здійснення вірусологічного моніторингу об'єктів довкілля необхідно для визначення інтенсивності циркуляції ентеровірусів на території, їх типового складу, наявності "диких" поліовірусів та оцінки ефективності роботи очисних споруд.
Рекомендовані методи дослідження об'єктів довкілля:
Вірусологічне дослідження води.
Дослідження стічних вод, води, відкритих водоймищ, питної води здійснюють під час проведення попереджувального та поточного санітарного нагляду, а також за епідеміологічними показниками.
У результаті дослідження стічних вод визначають рівні контамінації їх вірусами, типовий склад, його зміни протягом сезонів року та оцінюють ефективність роботи очисних споруд.
Відкриті та підземні водоймища досліджують на наявність вірусів при виборі їх як джерел водопостачання, планово та за епідемічними показниками.
Вірусологічні дослідження питної води здійснюють як планово, так і за епідеміологічними показаннями, погодивши з епідеміологом кратність і точки відбору зразків води.
1. Відбір проб води.
Проби відбирають у стерильний посуд, найбільш доцільно використовувати флакони з-під вірусологічних середовищ об'ємом 500 мл. Після відбору проб води флакони закривають гумовими стерильними корками і закріплюють лейкопластирем.
В лабораторію проби доставляють у сумках-холодильниках чи пенопластових коробках з сухим льодом чи термоелементами.
Термін доставки - до 6 годин від моменту відбору. В лабораторії вода підлягає дослідженню в перші години з моменту надходження. При необхідності її можна зберігати при +4 град.С протягом доби, а при -20 град.С і довше.
Кратність вірусологічного контролю стічних вод за умов поточного санітарного нагляду складає 1 раз на місяць. Порівняльно досліджують проби води до і після очистки. Загальна кількість води для досліджень складає 500 мл.
Відбір проб води поверхневих водоймищ здійснюють з мостів, помостів, плавзасобів, але в місцях, де глибина водоймищ не менше 0,5 м. Не рекомендується відбирати проби з берега. Воду в намічених місцях відбирають за допомогою барометра. Поверхневі проби відбирають з глибини 10-15 см від поверхні води, придонні - 30-50 см від дна. В зимовий період роблять ополонки, але таким чином, щоб у воду не потрапило забруднення з льоду чи інструментів. Посуд відкривають безпосередньо перед відбором.
При дослідженні води з артезіанських свердловин проби відбирають після тривалої відкачки води до постійного динамічного рівня. Стерильні пляшки чи флакони заповнюють водою, щільно закривають стерильним корком. Загальний об'єм води для дослідження складає 3 літри.
Проби питної води відбирають безпосередньо або через стерильні гумові шланги в скляний посуд об'ємом 10-20 л. При цьому водозабірній кран тричі обпалюють спиртовим факелом, і воду спускають протягом 15 хв.
Для дехлорування води в 10-літрові склянки до їх стерилізації вносять тіосульфат натрію з розрахунку 20 мг на 1 л води. Воду набирають у склянки з дехлоратором. Об'єм однієї проби води - 10-20 л.
2. Концентрація вірусів із води за допомогою бентоніту.
В основу принципу концентрації вірусів покладено їх здатність до адсорбції на частках бентоніту в кислому середовищі (рН 4,0-5,0) з подальшою елюцією в лужні розчини елюантів (рН 8,5-9,5).
Елюції вірусів з бентоніту в лужному середовищі перешкоджають катіони. Тому комплекс вірус-бентоніт попередньо відмивають (знесолюють) дистильованою водою в кислому середовищі.
На ефективність концентрації вірусів впливають: вміст органічних речовин у досліджуваних об'єктах, наявність двух-трьохвалентних катіонів, ступінь мікробного забруднення.
2.1. Концентрація вірусів із стічної води.
Якщо стічні води містять фекалії, побутові відходи та інші тверді частки, то воду попередньо слід звільнити від них. Для цього воду центрифугують при 1000 об/хв протягом 15 хв. або фільтрують через паперовий або ватно-марлевий фільтри. Отриманий фільтрат використовують для наступної концентрації ентеровірусів.
Слід відзначити, що під час попередньої обробки, разом з твердими частками видаляється також частина ентеровірусів. Щоб це не позначилось на результатах дослідження, рекомендується здійснити додаткову десорбцію ентеровірусів з осаду стічних вод. Для цього до осаду додають 0,5 М фосфатний буфер (Nа2НРО4, рН 8,0-8,3) в 0,88 М розчині NaCl у співвідношенні 1:2 - 1:3 (вага:об'єм). Суміш ретельно перемішують 5-10 хв., а потім центрифугують при 3500 об/хв протягом 20 хв. Надосадову рідину використовують для дослідження.
Концентрацію ентеровірусів із стічних вод здійснюють за такою схемою. Відбирають 500 мл стічної води, звільненої від твердих часток, додають NaCl до 0,1 М концентрації (6,0 г NaCl), 1,0 мл 5% гелю бентоніту і по краплям та під контролем рН 1 М розчин HCl чи ацетатний буфер до рН 4,5-5,0. (Гель бентоніту можна одержати в Українській референс-лабораторії з поліомієліту.)
В цих умовах при кислих значеннях рН відбувається адсорбція ентеровірусів на бентоніті. Вже через 4-5 хв. струшування матеріалу утворюється комплекс вірус-бентоніт, який осаджують центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 10 хв. При цьому на дні посуду, в якому здійснювали центрифугування, утворюється білий осад бентоніту в комплексі з адсорбованими на ньому вірусними частками. Для знесолювання комплексу вірус-бентоніт до осаду додають 15-20 мл дистильованої води і за допомогою піпетування та інтенсивного струшування переводять осад у гомогенну суспензію, яку переносять у центрифужний флакон і центрифугують при 3000-4000 об/хв протягом 15 хв. Надосадову рідину видаляють. Осад використовують для елюції ентеровірусів.
Для цього до осаду додають 2-3 мл 0,05 М розчину трисбуферу на дистильованій воді з рН 9,0 і інтенсивно струшують протягом 4-5 хв. Суспензію далі центрифугують при 4000 об/хв протягом 15-20 хв. і прозору надосадову рідину відбирають піпеткою. Таким чином одержують елюат-1. Але повного звільнення ентеровірусів з поверхні часток бентоніту не відбувається. Тому до осаду знову додають 1,5-2 мл 0,05 М розчину трис-буферу і процедуру елюції повторюють. Елюат-2 об'єднують з елюатом-1 у стерильному флаконі. Отриманий вірусний концентрат, як правило, містить до 90% вірусів від вихідної їх кількості. Тривалість усієї процедури концентрації - біля 1 години.
Концентрат вірусів підлягає деконтамінації - звільненню від сторонньої мікрофлори.
2.2. Дослідження осаду стічних вод.
Зразки осаду стічних вод або активного мулу відбирають в стерильний посуд загальним об'ємом 0,5 л. Проби старанно перемішують, розливають у флакони по 250 мл і центрифугують при 1500 об/хв протягом 20 хв. Для десорбції вірусів до кожного зразку додають елюючий розчин з розрахунку 1:2-1:10. Використовують суміш фосфатного буферу (рН 8,2) (1 частину) і м'ясопептонного бульону (9 частин). За допомогою 1 М розчину NaOH або 1 М розчину HCl встановлюють рН суміші в межах 8,6-8,8, проби струшують протягом 10 хв., а потім центрифугують при 3000 об/хв протягом 30 хв.
Більш ефективно десорбцію вірусів із осаду стічних вод або активного мулу здійснюють за допомогою 0,88 М розчину MaCl на 0,5 М розчині фосфатного буферу (Nа2РО4 - КН2РО4), що має показники рН 8,2-8,4. При цьому вдається десорбувати до 87% від загальної кількості адсорбованих вірусних часток.
Надосадову рідину використовують для концентрації вірусів за допомогою бентоніту за методом, що наведений в підрозділі "Концентрація вірусів із стічної води".
2.3. Концентрація вірусів із води поверхневих водоймищ.
До 1 л досліджуваної води додають 0,75 мл 5% гелю бентоніту. Для інтенсифікації адсорбції ентеровірусів на бентоніті у воду вносять СаСl2 до 0,01-0,1 М концентрації. Показник рН суміші доводять до 4,5-5,0 за допомогою 1 М розчину НСl, який додають по краплям. Значення рН контролюють за допомогою рН-метру або індикаторного паперу. Суміш інтенсивно струшують 3-5 хв. При цьому утворюється комплекс вірус-бентоніт, що випадає в осад при низькошвидкісному центрифугуванні при 1000-1500 об/хв протягом 20 хв. Надосадова рідина видаляється, а осад з метою знесолювання суспендують в 10 - 15 мл дистильованої води (рН 4,5). Потім суспензію центрифугують при 3000-4000 об/хв протягом 15 хв.
Елюцію вірусів з бентоніту здійснюють, як і в випадку з стічною водою, з використанням 0,05 М трис-буферу з рН 9,0.
Отриманий елюат в об'ємі 3-5 мл дедаконтамінують від бактеріальної мікрофлори і використовують для виявлення ентеровірусів.
2.4. Концентрація вірусів із питної води.
До досліджуваної проби питної води в об'ємі 20 л додають 5% гель бентоніту в кількості 5 мл. З метою інтенсифікації адсорбції ентеровірусів на бентоніті та прискорення седиментації осаду в досліджувану воду вносять стерильний розчин хлориду кальцію до 0,01 М концентрації. Суміш струшують 1-3 хв. Утворений комплекс вірус бентоніт осаджують або природним відстоюванням при 4 град.С протягом 14-18 годин, або низько-швидкісним центрифугуванням при 1000-1500 об/хв. протягом 20-30 хв.
Надосадову рідину зливають. Після деконтамінації осад вносять безпосередньо в основу середовища для виявлення ентеровірусних бляшок, якою заливають моношари чутливих культур клітин.
Через 48 годин після інкубації в термостаті при 36 град.С заражених моношарів культур клітин в них формуються вірусні бляшки, які характеризують кількісний вміст ентеровірусів в досліджуваній пробі води.
Якщо бляшки не виявляються під бентонітовим покриттям, останнє використовують як вірусвмісний матеріал для подальшого дослідження.
3. Вірусологічне дослідження грунту.
Зразки грунту відбирають у стерильні флакони переважно з поверхневих шарів з глибини 0-20 см, інколи - з глибини 50- 100 см для визначення процесів міграції вірусів у грунтові води. До наважки грунту в 5 г, яка міститься в стерильному флаконі об'ємом 100 мл, додають 50 мл 0,5 М розчину фосфатного буферу чи (рН 8,5) чи м'ясного екстракту на гліцериновому буфері (рН 9,5-10,0).
Пробу грунту перемішують і інтенсивно струшують протягом 5 хв. Отриману суспензію грунту центрифугують при 3000 об/хв протягом 10-15 хв. Концентрацію вірусів з надосадової рідини за допомогою бентоніта здійснюють за методикою, наведеною для стічних вод.
4. Вірусологічне дослідження продуктів харчування.
Здійснють за епідеміологічними показаннями при визначенні етіології захворювань людей з харчовим фактором передачі.
Зразки рідких харчових продуктів (молоко, кефір тощо) в об'ємі 200-300 мл обробляють реагентами для видалення білків, ліпідів. З цією метою до проби продукту об'ємом 10 мл додають 0,3 г кристалічного натрію цитрату (Nа2С6Н5О7 5,5 Н2О). Після перемішування протягом 20 хв на магнітній мішалці до проби додають 10 мл фреону-113 (відносна густина 1,36) і гомогенізують 2 хв. Суміш центрифугують при 3000 об/хв протягом 30 хв. Надосадову рідину використовують для подальшої концентрації вірусів за допомогою бентоніту або поліетиленгліколю (ПЕГ-4000 або ПЕГ-6000).
Напівтверді харчові продукти по 25-30 г піддають екстракції вірусів у рідині з лужними значеннями рН (0,5 М розчин фосфатного буферу, 0,1 М розчин гліколевого буферу) з наступним концентруванням вірусів за допомогою ПЕГ-4000 або ПЕГ-6000.
Аналогічні дослідження проводять із зразками твердих харчових продуктів (овочами).
Деконтамшацію вірусного концентрату здійснюють за допомогою ефіру або антибіотиків. Етиловий ефір використовують на проміжних і заключних етапах концентрації вірусів. Після центрифугування до осаду (вірус-бентоніт) вносять ефір у співвідношенні 1:5, суміш струшують і флакони під ватно-марлевими корками витримують у вакуумній камері при +4 град.С 18-24 години. Елюати доцільно обробляти ефіром у співвідношенні 1:1.
Антибіотики до елюату додають із розрахунку: пеніцилін 200-1000 ОД/мл, стрептоміцин - 200-500 мкг/мл (в залежності від інтенсивності контамінації мікроорганізмами). Для досягнення максимального ефекту деконтамінації названі способи можна поєднувати.
Додаток 1
до методичних рекомендацій
Вірусологічна діагностика
поліомієліту
Направлення на лабораторне дослідження
(додається до зразка фекалій, що надсилається в лабораторію)
ЕПІДНОМЕР:_______________________________________________________
Прізвище, ім'я та по батькові хворого:____________________
Адреса: _________________ Населений пункт:______________________
Район: ___________________ Область: _____________________________
Дата народження _________________________________________________
якщо не відома, вкажіть вік _____________________________________
Дата початку паралічу __________________________________________
Дата забору першого зразка фекалій ____________________________
Дата забору другого зразка фекалій _____________________________
Дата відправки зразків __________________________________________
Дата останньої вакцинації оральною
поліомієлітною вакциною _________________________________________
Попередній клінічний діагноз ____________________________________
Прізвище, ім'я та по батькові особи,
що проводила розслідування ______________________________________
Прізвище, ім'я та по батькові особи,
якій повинні бути направлені результати
лабораторного дослідження _______________________________________
Повна адреса:____________________________________________________
_________________________________________________________________
Телефон: ____________ Факс: ________________
_________________________________________________________________
(заповнюється в лабораторії)
Дата отримання зразків у лабораторії ____________________________
Прізвище, ім'я та по батькові особи,
яка отримала зразки _____________________________________________
Чи були зразки в задовільному стані*: Так Ні
Критерії "задовільно" стану зразка: достатній об'єм, не
протікає, не засох, показники термоіндекатора чи наявність лікоду
вказує на те, що "зворотний" холодовий ланцюг не порушено.
Додаток 2
до методичних рекомендацій
Вірусологічна діагностика
поліомієліту
Щоквартальна інформація про виділення поліовірусу
з проб фекалій
Назва лабораторії __________________________________________
N кварталу ________ Рік _________
1. Випадки ГВП
Проведені дослідження:
----------------------------------------------------------------
|Кількість|Кількість пацієнтів з|Загальна |Кількість пацієнтів |
|випадків |ГВП |кількість|з ГВП, |
|ГВП | |проб |у яких було взято 2 |
| | |фекалій |проби фекалій з |
| | | |інтервалом 24-48 г |
|---------+---------------------+---------+--------------------|
| |Із 1 про-|Із 2 чи | | |
| |бою фе- |більше про-| | |
| |калій |бами | | |
| | |фекалій | | |
|---------+---------+-----------+---------+--------------------|
----------------------------------------------------------------
2. Випадки ГВП
Результати:
------------------------------------------------------------------
| | Проби фекалій |Кількість|Загальна | З них виділено |
| | (усі) |проб |кількість | поліовірус типу|
| |-------------------|фекалій, |проб з |----------------|
| |позит.|позит|нега- |що |позитивним |П 1|П 2|П 3|Змі-|
| |проба |проба|тивна |дослід- |результатом| | | |ша- |
| | на | на |проба |жуються |на | | | |ні |
| |по- | ЕВ | | |поліовірус | | | | |
| |ліо- | + | | | | | | | |
| |вірус | | | | | | | | |
|-----+------+-----+------+---------+-----------+---+---+---+----|
|Пото-| | | | | | | | | |
|чний | | | | | | | | | |
|квар-| | | | | | | | | |
|тал | | | | | | | | | |
|-----+------+-----+------+---------+-----------+---+---+---+----|
|Попе-| | | | | | | | | |
|ред- | | | | | | | | | |
|ній | | | | | | | | | |
|квар-| | | | | | | | | |
|тал *| | | | | | | | | |
------------------------------------------------------------------
+ - Число виділених неполіомієлітних ентеровірусів
* - Поновлення результатів за попередній квартал ЕВ
ЕВ - Ентеровіруси
З. Контакти **
Результати:
---------------------------------------------------------------------
|Кон- |Кількість| Проби фекалій |Кількість|Контакти з позитивними|
|такт |проб фе- | контактів |проб |пробами на поліовірус |
| |калій |------------------|фекалій, |----------------------|
| |контак- |позит.|позит|нега-|що |П 1| П 2 |П 3|Змі- |
| |ту |проба |проба|тивна|дослід- | | | |ша- |
| | | на | на |проба|жуються | | | |ні |
| | |по- | ЕВ | | | | | | |
| | |ліо- | + | | | | | | |
| | |вірус | | | | | | | |
|-----+---------+------+-----+-----+---------+---+-----+---+--------|
|Пото-| | | | | | | | | |
|чний | | | | | | | | | |
|квар-| | | | | | | | | |
|тал | | | | | | | | | |
|-----+---------+------+-----+-----+---------+---+-----+---+--------|
|Попе-| | | | | | | | | |
|ред- | | | | | | | | | |
|ній | | | | | | | | | |
|квар-| | | | | | | | | |
|тал *| | | | | | | | | |
---------------------------------------------------------------------
+ - Число виділених неполіомієлітних ентеровірусів
* - Поновлення результатів за попередній квартал
ЕВ - Ентеровіруси
** Під словом контакт(и) маються на увазі особи, що
безпосередньо спілкувалися з хворим
4. Показники ефективності роботи
Період часу між початком паралічу і відбором проб
фекалій:
(вказати лише ті випадки, для яких відомі дати відбору проб і
початку паралічу).
------------------------------------------------------
| Кількість | <= 14 діб | 15-28 діб | >= 28 діб |
| випадків | | | |
|-----------+-----------+-----------+----------------|
------------------------------------------------------
Період часу між початком паралічу і відбором проб
фекалій
(Прохання включати тільки ті проби фекалій, дата відбору яких
відома)
---------------------------------------------------------------
| | Кількість проб | <= 72 год | 4-7 діб | >= 7 діб |
|--------+----------------+-----------+----------+------------|
|Хворі | | | | |
|--------+----------------+-----------+----------+------------|
|Контакти| | | | |
|--------+----------------+-----------+----------+------------|
|Разом | | | | |
--------------------------------------------------------------- 5. Стан отриманих проб:*
Загальна кількість проб фекалій пацієнтів з ГВП та контактів
----------------------------------------------------------------
|Кількість | Кількість зразків | Кількість зразків |
|зразків | задовільної якості | незадовільної якості |
|-----------+-----------------------+--------------------------|
----------------------------------------------------------------
* Критерії: наявність льоду у пробі, достатній об'єм,
відсутність протікання, сухість проби. 6. Період часу між отриманням проби і відправленням
звіту:
Загальна кількість проб фекалій пацієнтів з ГВП і контактів,
що отримані протягом кварталу.
--------------------------------------------------------------------
|Квартал | Кількість | <= 28 | 29-42 | >=42 | Проби, що до- |
| | проб фекалій | діб | доби | діб | сліджуються* |
|------------+--------------+-------+-------+------+---------------|
|Поточний | | | | | |
|------------+--------------+-------+-------+------+---------------|
|Попередній**| | | | | |
-------------------------------------------------------------------- * - Кількість проб фекалій, що отримані для дослідження
протягом кварталу, але звіт по яким поки що не відправлений у
зв'язку з відсутністю результатів дослідження.
** - Поновлення інформації про період часу, який пройшов між
отриманням проб і відправленням звітів по пробах, що були отримані
на протязі попереднього кварталу.
Примітки/потреби
Підпис: Дата:
Посада:Інструкції по заповненню щоквартальної інформації
про виділення поліовірусів з проб фекалій
1. Випадки ГВП. Проведені дослідження.
Випишіть кількість пацієнтів з ГВП, проби фекалій яких були надіслані вашу лабораторію, а також кількість таких пацієнтів з однією або більше пробами фекалій. Випадок ГВП з кількома пробами фекалій занотовується як цифра 1 у другій колонці. Під рубрикою "загальна кількість проб фекалій" впишіть всі проби фекалій хворих з ГВП.
2. Випадки ГВП. Результати.
Пам'ятайте, що лівий бік цієї таблиці відноситься до проб фекалій, а правий - до випадків ГВП. "Проби фекалій (усі)" - це проби, аналіз яких закінчено, тобто з повною ідентифікацією вірусів або негативними результатами аналізу. Всі інші проби є "такими, що досліджуються", і результати по ним слід записати в нижньому рядку в наступному кварталі.
Усі проби з поліовірусами повинні бути вміщені до стовпчику "позит. проба на поліовірус". Усі проби з неполіомієлітним ентеровірусом повинні бути вміщені до стовпчику "позит. проба на ЕВ". Таким чином, проба, із якої виділені поліовірус та ЕСНО-вірус, повинна бути представленою у двох стовпчиках.
Під рубрикою "позит. проба на поліовірус" представте загальну кількість ПАЦІЄНТІВ З ГВП, з проб яких було виділено поліовірус, під рубрикою "П 1"- випадки, з проб яких було виділено поліовірус 1 типу і так далі. Якщо з однієї або декількох проб фекалій тієї ж самої особи виділено кілька типів поліовірусів, цей випадок слід розмістити під рубрикою "змішані".
3. Контакти (особи, що спілкувалися з хворим).
Ті ж самі інструкції відносяться і до результатів проб фекалій контактів. Кількість проб фекалій і кількість контактів повинні бути однаковими, оскільки для кожного контакту потрібна тільки одна проба. Якщо від однієї особи надіслано, більш ніж одна проба, їх можна змішати і піддати аналізу як одну пробу.
4. Показники ефективності роботи.
Період часу між початком паралічу і збором проби фекалій:
В стовпчик "<= 14 діб" слід вписати випадки, коли першу пробу фекалій було зібрано не пізніше 14 діб після початку паралічу.
Період часу між збором і отриманням проби.
Представте дані про УСІ проби, термін взяття яких відомий. Якщо відомо, що проби, які надійшли більше ніж через три доби після їх збору, зберігалися при температурі - 20 град.С, то в рубриці "Примітки" слід вказати їхню кількість.
Стан отриманих проб.
Для того, щоб пробу можна було зареєструвати як "задовільної якості", вона повинна задовольняти усім наведеним критеріям. Якщо проби надсилають з безводними холодовими елементами, слід вимірити температуру в контейнері, яка повинна бути нижче за 8 град.С.
Затверджено
наказ Міністерства охорони
здоров'я України
від 15.04.1998 р. N 96
Методичні рекомендації
Клінична діагностика поліомієліту
ПОЛІОМІЄЛІТ (хвороба Гейне-Медіна, дитячий спинальний параліч) - це гостра, інфекційна хвороба з явищами загальної інтоксикації й ураженням нервової системи переважно у вигляді гострих млявих парезів та паралічів, для яких характерна втрата сухожильних рефлексів, атонія та атрофія уражених м'язів. Усі три типи поліовірусів здатні спричиняти паралітичне захворювання.
При поліомієліті первинне розмноження вірусу відбувається переважно в епітеліальних клітинах тонкої кишки, у меншій кількості - у клітинах епітелію глотки. Внаслідок цього відбувається активація місцевого імунітету, яка пов'язана, перш за все, з синтезом специфічних секреторних IgА. Це має суттєве значення для захисту організму при його повторному інфікуванні. Накопичення вірусу з наступною його генералізацією відбувається у лімфатичних регіонарних вузлах, після цього настає дисемінація вірусу у кров з можливим утворенням вогнищ розмноження у різних органах і тканинах, лімфатичних вузлах і наступним ураженням клітин передніх рогів спинного мозку та ядер рухових черепних нервів у стовбурі великого мозку. Але інфекційний процес частіше переривається на стадіях розмноження вірусу у кишечнику і первинної (малої) вірусемії. Тому у більш ніж 90% інфікованих осіб не відмічаються клінічні симптоми захворювання (вірусоносійство), у 4-8% - захворювання проходить в абортивній формі без порушень рухомості. Лише у 1-10 із кожних 1000 інфікованих осіб (0,1-1,0%) розвивається паралітична форма з ураженням мотонейронів клітин переднього рогу спинного мозку, денервацією м'язів з наступним стійким випаданням їх функцій. Ураження цих субстанцій - результат складних обмінних порушень, які виникають при взаємодії нервових клітин і поліовірусу. Постійною морфологічною ознакою вважають порушення будови тигроїдної речовини клітин переднього рогу спинного мозку, його тигроліз. Деструкції підлягають ядра й ядерця клітин нейронів, що є ознакою необоротньої зміни у клітині і призводять до стійкого випадіння функції. На місці клітин, що загинули, відбувається розростання гліозної тканини, функція клітин необоротно втрачається.
У передніх рогах спинного мозку поряд із клітинами, що змінилися й розпалися, можуть бути і незмінені клітини. Ця мозаїчність ураження мотонейронів пояснює безладність, асиметрію парезів і паралічів, типових для поліомієліту. Залежно від превалюючих уражень та клінічних проявів розрізняють:
- поліомієліт без уражень нервової системи: 1) інапарантна форма, 2) абортивна форма;
- гострий поліомієліт з ураженням нервової системи: 1) менінгіальна, непаралітична форма, 2) паралітична форма спинальна, бульбарна, понтинна та змішана (понтоспинальна, бульбоспинальна, бульбопонтоспинальна).
Спинальна форма протікає з локалізацією процесу у шийному, грудному, поперековому відділах спинного мозку, може бути обмеженою чи розповсюдженою.
Поліомієліт диференцюють за вираженістю клінічних симптомів перебігу на: легку, середньо-тяжку і тяжку форми. За наслідками захворювання розрізняють випадки із: повним відновленням порушених функцій, із залишковими розладами руху у без трофічних порушень чи з ними.
Інкубаційний період при різних формах поліомієліту частіше становить 7-14 діб, але може скорочуватися до 2-х діб чи продовжуватись до 35 діб.
Інапарантна форма поліомієліту проходить без клінічних проявів, але із серологічними змінами в організмі.
Абортивна форма супроводжується підвищенням температури, головним болем, іноді - болем у горлі та катаральними явищами, слабістю, млявістю, зниженням апетиту, нудотою, блюванням. Ці ознаки можуть доповнюватися пітливістю, гіперестезією, діареєю, болем у животі. Через 3-7 днів усі явища зникають, відбувається повне видужання. Без чітких епідеміологічних даних і лабораторного підтвердження діагностика цієї форми становить великі труднощі.
Менінгіальна форма у дітей протікає по типу серозного менінгіту. Під час першої хвилі лихоманки (2-3 доби) вона повністю нагадує абортивну. Це так звана "мала хвороба". Після зниження температури дитина відчуває себе добре 1-3 дні, але хвороба може мати одно- або двохвильовий перебіг. Потім відбувається знову підвищення температури і настає "велика хвороба" з усіма ознаками менінгіту: різкий головний біль, повторне блювання, ригідність м'язів потилиці, симптоми Керніга, Брудзинського, гіперестезія. У церебральній рідині виявляють зміни, характерні для серозного менінгіту: помірний лімфоцитарний цитоз, підвищення вмісту білку. Через 2-3 тижні настає повне видужання, проте ще деякий час спостерігається астенічний синдром. Для дорослих двохвильова лихоманка менш типова, ніж для дітей.
Паралітичні форми поліомієліту розвиваються з певною послідовністю. У перебігу хвороби розрізняють стадії: інкубаційну, препаралітичну, паралітичну, відновлення (реконвалесценції) та резидуальну.
Період препаралічів передує розвитку паралічів. Частіше він продовжується 3-6 діб, але може скорочуватись до 36-48 годин чи розтягуватися на більш тривалий час. Описані випадки миттєвого розвитку паралічів, так звані "вранішні паралічі", але трапляються вони рідко.
Захворювання починається гостро з підвищення температури та появи симптомів інтоксикації. Характерною вважається двохвильова чи двогорба температурна крива, для першої хвилі типовим є перебіг поліомієліту як "малої хвороби". Вже у цей період виникають симптоми, що вказують на залучення до процесу корінців спинного мозку і оболонок головного мозку. Вони можуть бути обгрунтуванням для ранньої діагностики поліомієліту. У хворих розвиваються головний біль, блювота, різноманітні больові симптоми, менінгіальні знаки, судоми, мязові спазми, вегетативні розлади - пітливість, зниження артеріального тиску, прискорення пульсу, червоний дермографізм.
Місцевий біль і гіперестезії можуть бути виражені настільки сильно, що маскують парези і паралічі, що з'являються в найближчий час. Внаслідок болю хворі приймають вимушені пози, у них відмічаються симптоми напруження мязів спини. Паралічі з'являються раптово. Іноді підвищення температури триває протягом кількох діб, потім критично падає, і вже тоді розвиваються парези й паралічі.
Загальноінфекційні симптоми зменшуються, свідомість прояснюється, але біль і вегетативні порушення можуть тривати чи навіть посилюватися, парези і паралічі, розлад рухів прогресують. Тривалість паралітичного періоду становить до 6 діб, хоча інколи він розтягується до двох тижнів. З 5-10 доби паралітичного періоду ясно визначається форма ураження і прогноз захворювання.
Клінічна форма вогнищевих спинальних форм поліомієліту полягає у порушенні функцій різноманітних мязів. Ураження мязів шиї призводить до їх слабкості, хворий не може утримувати голову у вертикальному положенні. При пальпації паретичних м'язів шиї відмічається слабке їх напруження, млявість, зниження сили. Серед мязів верхніх кінцівок найчастіше до процесу залучається дельтовидний м'яз, внаслідок чого стає неможливим підведення та відведення руки. Параліч мязів верхніх кінцівок співпадає із сегментарною інервацією діафрагми, тому парези рук можуть супроводжуватися ураженням діафрагми.
У нижніх кінцівках частіше вражаються мало - і великогомілкові м'язи, м'язи стегна, чотирьохголовий розгинач гомілки.
Згідно з даними більшості авторів, при поліомієліті найчастіше уражається люмбальний відділ спинного мозку, що призводить до розвитку парезів і паралічів м'язів кульшового суглобу та нижніх кінцівок. Ступень ураження м'язів може бути різним - від легких, що швидко минають до тяжких, розповсюджених, з ураженням м'язів усієї кінцівки і тулуба, найчастіше у вигляді параплегій. У подальшому поліомієліт може набувати висхідного характеру: процес, починаючись з нижніх кінцівок, захоплює верхні кінцівки, шию. Ураження діафрагми може призвести до зупинки дихання.
Параліч охоплює тільки частину м'язів, у той час як функція інших зберігається . Таке "клаптеподібне" ураження призводить до того, що між ними порушується звичайне взаємовідношення, виникають контрактури, деформації, які важко піддаються вправленню. В уражених кінцівках спостерігаються порушення кровообігу, вони стають холодними на дотик, шкіра набуває синюшного відтінку, уповільнюється ріст кісток.
Бульбарна форма поліомієліту супроводжується порушенням функцій довгастого мозку і варолієвого мосту та інших найважливіших структурних утворень мозкового стовбуру. Залежно від локалізації та глибини ураження ядер черепних нервів, що розташовані у цих утвореннях, розрізняють бульбарний поліомієліт з уражєнням верхньої та нижньої групи черепних нервів.
Якщо патологічний процес локалізується лише у нижньому відділі моста, уражується ядро лицевого нерва, розвивається парез або параліч мімічних мязів, що клінічно характеризується згладженістю носогубної складки, розширенням очної щілини, зміщенням кута рота у здоровий бік, неповним заплющенням ока, розгладженістю половини лоба. На боці паралічу відмічається рідке моргання, сльозоточивість, при вискалюванні зубів кут рота зміщується у здоровий бік. Відновлення функції мімічних м'язів звичайно починається з 10-14 доби і закінчується більшості випадків повним видужанням. Така форма хвороби зветься понтинною і зустрічається як ізольована дуже рідко.
Бульбарна форма відзначається гострим початком і тяжким перебігом з великим відсотком летальності. На фоні значного підвищення температури спостерігаються різкий головний біль, нудота, блювання, незначні менінгіальні симптоми. Вже на 2-3 добу з'являються, ністагм, порушення ковтання, кашель під час їжі та пиття, витікання води через ніс, неможливість проковтнути слину і слиз. До парезу м'язів глотки може приєднатись ураження м'язів гортані - глухий голос, іноді афонія, задишка, порушення ритму дихання. У випадку бульбарного паралічу з ураженням дихального центру порушується ритм дихання, швидко прогресують судинні розлади, які поглиблюються при одночасному ураженні судиннорухового центру. Спостерігається тотальний цианоз, різке зниження артеріального тиску.
Нерідкі випадки поєднання уражень черепних нервів із спинальними розладами. Коли порушення функції життєво важливих центрів посилюється спинальними розладами, виникають понтоспинальні, бульбоспинальні і бульбопонтинні форми поліомієліту.
У відновлювальний період і період залишкових явищ іде поступове відновлення порушених функцій. Перші рухи зявляються на 15-20 добу хвороби і пізніше. Особливо активно відновлювальний процес іде протягом перших трьох місяців хвороби, потім він уповільнюється, але за сучасними даними може тривати десятиріччя.
Після закінчення періоду відновлення стійкі парези і паралічі розглядаються як залишкові явища - резидуальний період. Глибокі паралічі призводятьдо атрофії м'язів, деформації суглобів, сухожиль, зв'язок, що спричиняє відставання у рості, остеопороз, вивихи, трофічні зміни. У стадії залишкових явищ нерідко спостерігаються кіфоз, лордоз, сколіоз, грижі черевної стінки, кінська або п'яткова стопа, косолапість та інші аномалії.
Небезпечність розвитку паралічу при інфікуванні поліовірусом підвищується за умов активного фізичного навантаження, тонзилектомії, внутрішньом'язових інфекцій. Параліч уражає ту кінцівку, в яку проводиться ін'єкція. Тонзилектомія підвищує небезпечність захворювання на бульбарну форму поліомієліту. У зв'язку з підвищеним ризиком виникнення паралічу не раціонально проводити хірургічні втручання при реєстрованих спалахах поліомієліту. Доцільно проводити лише найбільш важливі ін'єкції.
Поліомієліт - захворювання переважно дитячого віку. Але відомі епідемії серед дорослих. Своєрідність пєребігу його у дорослих полягає у тому, що нетиповою є двохвильова лихоманка, больовий синдром більш інтенсивний, частіше порушуються функції тазових органів, паралітичний період довший, спостерігається більш в'яле відновлення рухів.
Діагноз, диференціальний діагноз
У типових випадках діагностика поліомієліту особливих труднощів не становить. Наявність в'ялих паралічів, частіше нижніх кінцівок, які з'явилися після гарячкового періоду, їх асиметрія, проксимальна локалізація, збереження чутливості характерно для поліомієліту. Однак у сучасних умовах, коли реєструються поодинокі захворювання і легкі форми перебігу хвороби у щеплених, установити діагноз в окремих випадках важко. Необхідно виключити захворювання з обмеженою рухомістю в кінцівках, пов'язаних з хворобами опорно-рухового апарату - травма, епіфізарний остеомієліт, ревматизм з обмеженою рухомістю в суглобах тощо.
Найчастіше в'ялі розлади руху необхідно диференціювати з синдромом Гійена-Барре, травматичним невритом сідничого нерву, поперековим мієлітом.
Синдром Гіена-Барре - полірадикулоневрит, який характерезується периферичними паралічами м'язів кінцівок, є ускладненням різних інфекційних хвороб (інфекційно-алергічної природи). Але полірадикулоневриту властиві дистальна локалізація парезів і паралічів, їх симетричний поступовий розвиток, порушення чутливості. Поряд з больовим синдромом виникають гіпо- і гіперплазії, зниження м'язево-суглобної чутливості в пальцях кінцівок. Після видужання резидуальні зміни незначні.
Травматичний мієліт з ураженням сідничого нерву, який виник у результаті ектопірованої ін'єкції в сідничий м'яз, потребує диференціації від індукованого поліомієліту. Ймовірність того, що захворювання має поліомієлітну етіологію, висока у випадках, коли з появою паралічу співпадає підвищення температури або поява паралічу носить раптовий характер.
Значні труднощі виникають при диференціальній діагностиці поліомієліту і захворювань, що об'єднані в групу поліомієлітоподібних. Найчастіше вони спричиняються ентеровірусами Коксакі та ЕСНО і відрізняються гострим виникненням паралічів без попереднього початкового періоду, меншою тяжкістю, швидким відновленням порушених функцій уражених м'язів. Залишкові явища у вигляді стійких паралічів і парезів, атрофій реєструються рідко. Винятком є віруси Коксакі А-7 та ентеровірус типу 71, які спричиняють паралітичні захворювання, що не відрізняються від бульбоспинальних форм поліомієліту. Постановка діагнозу в таких випадках можлива лише за умов проведення вірусологічного дослідження.
Поліомієлітоподібна форма кліщового енцефаліту не має ознак, характерних для препаралітичної стадії поліомієліту, розвиток парезів не раптовий, а повільний, спочатку не дуже помітний. Беруть до уваги перебування в епідемічних зонах, укуси кліщів, професію хворого, вік. При кліщовому енцефаліті більш характерні паралічі м'язів шиї, верхніх кінцівок.
Понтинна форма поліомієліту потребує виключення паралічів лицевого нерву іншої причини. У разі поліомієлітної етіології ураження лицевого нерву не має болі, гіперакузії, сльозотечі, порушення смакової чутливості передніх 2/3 язика на боці пошкодження.
ЗГІДНО З РЕКОМЕНДАЦІЯМИ ВООЗ доцільна двоступінчата постановка діагнозу: попередня - за даними епідеміологічних і клінічних спостережень, і заключна - з урахуванням результатів вірусологічного і серологічного дослідження.
Лікування
Усі хворі з підозрою на поліомієліт незалежно від тяжкості перебігу захворювання повинні бути госпіталізовані. Лікування поліомієліту залежить від форми і стадії хвороби. Воно повинне бути комплексним і відбуватися за участю лікарів різних спеціальностей.
У плані лікування необхідно передбачити методи підвишення імунобіологічних сил організму, боротьбу з інтоксикацією і порушенням вісцеральних функцій, болючих явищ, зняття реактивних запальних змін, застосування стимулюючої та відновлюючої терапії, лікування залишкових явищ, соціально трудове улаштування хворих при наявності стійких залишкових явищ. Але всі ці компоненти лікування слід використовувати не одночасно, а обережно, поетапно.
Етіотропних засобів для лікування хворих на поліомієліт немає. Інтерферон (реаферон) та інтерфероногени відчутного ефекту не дають. Введення імуноглобуліну не гарантує від розвитку паралічів.
У препаралітичній і паралітичній стадіях потрібен повний спокій, суворий постільний режим, призначення анальгетиків, седативних засобів, детоксикація, переважно пероральна або у вигляді внутрішньовенних вливань особливо поєднані з дегідратацією. Ефективними є гарячі вологі обгортання уражених м'язів. Треба стежити, щоб положення тіла, уражених кінцівок хворого було правильним. Ранній ортопедичний режим попереджує розтяг м'язів, розвиток деформацій і контрактур.
Призначають також гіпосенсибілізуючі, протизапальні, антигістамінні препарати.
Хворі з бульбарними розладами потребують проведення реанімаційних заходів із застосуванням апаратури для штучної вентиляції легень, відсмоктування слизу з дихальних шляхів.
У стадії відновлення застосовують теплові процедури, масаж, легку лікувальну гімнастику.
Медикаментозне лікування повинне бути вкрай обережним. Велика кількість ліків лише обтяжує перебіг захворювання.
Стимулюючу терапію можна починати лише після повного закінчення активного процесу у спинному мозку (тобто не раніше 3-4 тижня), вона повинна бути необтяжливою для хворого, вибір - індивідуальний.
Не раніше 14-20 доби від початку хвороби у період зменшення болю і появи рухів призначають стимулятори міжневральної та мотоневральної провідності - прозерин, дибазол. Призначають також галантамін, секурінін, нивалін, стефоглобін. Через місяць, якщо потрібно курс лікування повторюють. Показані курси судинних, метаболічних засобів, антиоксидантів: актовегін, істенон, трентал, ноотропіл (пантагам, фенібут), вітамін Є, епаден.
Застосовуються амінокислоти (глутамінова кислота, сульфатирозін), які поліпшують обмін речовин і позитивно впливають на процеси відновлення. Для поліпшення функції м'язів призначають вітаміни групи В, нікотинову кислоту, препарати, які утримують солі фосфору, кальцію, калію, ліпоцеребрін, метіонін, токоферола ацетат. До курсу лікування включають також біогенні стімулятори (пірогенал, алое, ФіБС та ін.).
У ранньому періоді відновлення протягом 20-25 діб призначають анаболічні гормони (неробол, ретаболіл). Ще раз треба підкреслити, що не слід призначати всі препарати одночасно.
Діти, хворі на поліомієліт, повинні оглядатися лікарем ортопедом для вирішення питання ортопедичного лікування і протезування. Для усунення деформацій і поліпшення функцій кінцівок показані фізіотерапевтичні лікувальні засоби, санаторнокурортне лікування у спеціалізованих санаторіях (Євпаторія, Одеса).
Тривалий догляд за хворими, їх етапне лікування і реабілітація здійснюються шляхом спадкоємності різних лікувальних закладів (стацюнар-поліклініка-санаторій).
Затверджено
наказ Міністерства охорони здоров'я
України від 15.04.1998 р. N 96
( Склад втратив чинність на підставі Наказу МОЗ
N 196 від 14.07.98 )
Склад
комісії для заключної оцінки
випадків гострих в'ялих паралічів 1. Широбоков В.П. Директор Українською референс-лабораторії
з поліомієліту, співголова комісії
2. Крамарєв С.О. Головний дитячий інфекціоніст МОЗ України,
співголова комісії
3. Мартинюк В.Ю. Головний дитячий невролог МОЗ України
4. Руденко А.М. Головний інфекціоніст МОЗ України
5. Тришкова Л.О. Професор кафедри дитячих інфекційних
хвороб Національного медичного
університету
6. Задорожна В.І. Зав.лабораторією Київського НДІ
епідеміології та інфекційних хвороб
7. Миколенко Н.І. Зав.вірусологічною лабораторією
міської СЕС м.КиєваЗатверджено
наказ Міністерства охорони здоров'я
України від 15.04.1998 р. N 96
( Склад втратив чинність на підставі Наказу МОЗ
N 196 від 14.07.98 )
Склад
комісії по підготовці до сертифікації України
як території вільної від поліомієліту Смірнов В.В. - директор Інституту загальної мікробіології та
вірусології НАН України, Голова комісії (за згодою)
Члени комісії:
1. Некрасова Л.С. Перший заступник Міністра, Головний державний
санітарний лікар України
2. Гойда Н.Г. Начальник Головного управління медичної
допомоги дітям і матерям МОЗ України
3. Піщиков В.А. Начальник Головного Управління лікувально-
профілактичної допомоги МОЗ України
4. Баранова Т.Ф. Начальник Головного економічного управління
МОЗ України
5. Падченко А.Г. Заступник начальника Головного
санепідуправління МОЗ України
6. Сельнікова О.П. Директор Київського НДІ епідеміології та
інфекційних хвороб МОЗ України
7. Фролов А.Ф. Зав. кафедрою Київської медичної академії
післядипломної освіти
8. Корчак Г.І. Зав. лабораторією Українського наукового
гігієнічного центру МОЗ України
9. Доброштан Є.В. Зав. відділенням Українського інституту
громадського здоров'я
10. Чудна Л.М. Професор Київського НДІ епідеміології та
інфекційних хвороб МОЗ України