МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
НАКАЗ
30.05.2007 N 284
Про затвердження методичних вказівок
"Санітарно-вірусологічний контроль
водних об'єктів"
Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідеміологічного благополуччя населення" ( 4004-12 ), з метою науково-методичного забезпечення державного санітарно-епідеміологічного нагляду наказую:
1. Затвердити методичні вказівки "Санітарно-вірусологічний контроль водних об'єктів" (додаються).
2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду (Пономаренко А.М.) ці методичні вказівки довести до відома керівників установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби, міністерств, інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку.
3. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Пономаренка А.М.
Перший заступник Міністра,
головний державний санітарний лікар України С.П.Бережнов
Затверджено
Наказ Міністерства
охорони здоров'я України
30.05.2007 N 284
Методичні вказівки
"Санітарно-вірусологічний контроль
водних об'єктів"
1. Загальні положення
1.1. Методичні вказівки "Санітарно-вірусологічний контроль водних об'єктів" (далі - методичні вказівки) встановлюють єдині вимоги щодо організації відбору проб та виконання санітарно-вірусологічних досліджень води різного виду водокористування і ступеня забруднення по відношенню до її епідемічної безпеки за санітарно-вірусологічними показниками, у т.ч. питної води за показниками Державних санітарних правил і норм "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання", затверджених наказом МОЗ України від 23.12.96 N 383, зареєстрованим в Мін'юсті України 15.04.97 за N 136/1940.
1.2. Методичні вказівки призначені для використання при здійсненні контролю якості води (питної, господарсько-побутового призначення, відкритих водойм, стічної, води для зрошення сільськогосподарських угідь тощо) за вірусологічними показниками під час проведення державного санітарно-епідеміологічного нагляду та можуть бути використані для проведення відомчого та всіх інших видів контролю, незалежно від підпорядкованості і форм власності лабораторій.
2. Терміни та їх визначення
У цих методичних вказівках застосовуються такі умовні скорочення:
АГ - антиген
АТ - антитіло
БТО - бляшкоутвірних одиниць
ВТС - вірусне транспортне середовище
ВГА та ВГЕ - вірус гепатиту А та вірус гепатиту Е
ГГМКК - гідрогель метилкремнієвої кислоти
ДНК - дезоксирибонуклеїнова кислота
ЕМ - електронна мікроскопія
ЕД - еритроцитарний діагностикум
ЕФ - електрофорез
ІЕМ - імунна електронна мікроскопія
ІАР - імунна асцитна рідина
ІФА - імуноферментний аналіз
ІХА - імунохроматографічний аналіз
ККІД50/мкл - доза, інфікуюча в 50% культуру клітин
НВЧ - найбільш вірогідне число
НК - негативний контроль
НКЗ - негативний контрольний зразок
НПЕВ - неполіомієлітні ентеровіруси
НЦМ - нітроцелюльозна мембрана
МФА - метод флуоресціюючих антитіл
ПААГ - поліакриламідний гель
ПЕГ - поліетиленгліколь
ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція
ПК - позитивний контроль
ПКЗ - позитивний контрольний зразок
РВ - ротавірус
РЛА - реакція латексаглютинації
РН - реакція нейтралізації
РНГА - реакція непрямої гемаглютинації
РНК - рибонуклеїнова кислота
РотаАГ - ротавірусні антигени
РВІ - ротавірусна інфекція
ФП - фільтр Петрянова
ЦПД - цитопатична дія
ЦПД50/мл - мінімальна доза вірусу, що викликає цитопатичну дію в 50% заражених клітинних культур (клітинних моношарів)
3. Відбір проб для досліджень
Основними об'єктами санітарно-вірусологічного дослідження є:
- стічні води;
- стічні води на етапах очистки та знезаражування;
- вода відкритих водойм, що використовуються як джерела водопостачання;
- водопровідна вода;
- вода підземних джерел;
- питна вода у розвідній водопровідній мережі;
- вода питна доочищена;
- вода питна бутильована;
- вода морських і прісних водойм, що використовуються для рекреаційних потреб;
- вода плавальних басейнів та аквапарків.
Санітарно-вірусологічне дослідження водних об'єктів здійснюється під час проведення запобіжного та поточного державного санітарно-епідеміологічного нагляду, а також за епідемічними показаннями.
Санітарно-вірусологічне дослідження води складається з етапів:
- відбір проб для дослідження;
- підготовка проб для дослідження (первинна обробка матеріалу);
- концентрація вірусів у пробах води;
- деконтамінація вірусного концентрату;
- вірусологічне дослідження (виділення вірусу або виявлення його антигенів та фрагменту геному).
Відбір проб води здійснюють, дотримуючись загальних вимог, що забезпечують збереження вірусів у пробі та не допускають забруднення вторинною мікрофлорою. Проби відбирає проінструктований працівник лабораторії, який працює в медичному халаті (спецодязі) та латексних або гумових рукавичках. Після відбору проб рукавички обробляють 70% етиловим спиртом, по завершенню роботи - халати та рукавички підлягають стерилізації.
Одержаний матеріал маркують, заповнюють направлення на дослідження, зазначаючи місце (населений пункт), точку відбору, назву проби та дату (число, місяць, рік). Термін доставки матеріалу в лабораторію повинен не перевищувати 6 годин з моменту його відбору. Проби води доставляють у лабораторію, дотримуючись правил холодового ланцюга (з холодовими елементами в сумках - холодильниках, пластикових коробках тощо). Доставлений матеріал обробляють у лабораторії в перші години з моменту його надходження. Якщо не можливо провести дослідження в цей день, можна зберігати доставлені проби при температурі +4 +- 0,1 град. С впродовж доби. Кожну пробу обов'язково реєструють в робочому журналі.
3.1. Стічні води
Місцями відбору проб стічних вод є оглядові колодязі, відкриті частини колектора, а також очисні споруди до і після очистки. За умови поточного санітарного нагляду (систематичного вірусологічного контролю) за стічними водами проби відбирають 1-2 рази на місяць, у разі зміни епідемічної ситуації кратність взяття проб визначає епідеміолог.
Відбір проб стічної води здійснюють різними методами. Існують два принципово відмінних між собою способи відбору проб води. Перший спосіб можна визначити як "захват" (grab), а другий - як "засідка" чи "ловушка" (trap). При першому способі відбір проб води здійснюється одномоментно в певний проміжок часу у стерильний посуд. Проби у другий спосіб відбираються з попередньою адсорбцією вірусів безпосередньо у воді досліджуваного об'єкту. Такий спосіб відбору проб ще має назву адсорбційного і здійснюється за допомогою марлевих тампонів за Moore та пакетиків, що заповнені адсорбуючим матеріалом (з іонообмінними смолами, макропористим склом, активованим вугіллям, бентонітом тощо).
Вибір методу відбору залежить від можливостей вірусологічної лабораторії, умов транспортування та від того, наскільки цей метод є зручним для співробітників лабораторії в подальшій роботі.
Важливо враховувати доступність та необхідну стандартизацію адсорбенту!
Відбір проб за допомогою марлевих тампонів
Проби стічної води можна відбирати за допомогою марлевих тампонів за Moore: нарізають марлю на серветки, розміром 10 х 10 см, кладуть їх одну на одну пошарово в 48 шарів, пронизують через них капронову шворку або нитку і міцно фіксують усі шари марлі, запаковують тампон у папір, стерилізують, лишаючи кінець шворки в 1,5 м ззовні. У місці відбору проб фіксують вільний кінець шворки на дроті, що закріплений над колектором, знімають обгортку і занурюють тампон на 1-2 доби в потік стічних вод. Після експозиції тампони витягують, переносять в стерильний поліетиленовий мішечок чи в стерильну скляну банку та щільно (герметично) закривають.
Недоліком відбору проб за допомогою марлевих тампонів є неможливість забезпечити необхідну стандартизацію адсорбенту.
Проте метод надзвичайно простий, доступний та економічний.
Відбір проб стічних вод в посуд
Відбір проб води способом "захват" одномоментно є більш перспективним і надійним способом, регламентованим ВООЗ в рекомендаціях щодо нагляду за поліовірусом в об'єктах довкілля.
Пробу із загального потоку стічних вод можна відбирати вручну за допомогою спеціального пристрою (батометру) у стерильний скляний посуд об'ємом 1,0 л (наприклад, дуже зручно відбирати у стерильні скляні пляшки об'ємом 500 мл з-під поживних середовищ для культури клітин) або матраци для культури клітин, об'ємом 1,0-1,5 л, які заповнюють на дві третини.
Сучасні очисні споруди оснащені автоматичними пристроями для відбору проб води у скляний посуд з чітко фіксованим інтервалом часу впродовж доби. З отриманих у такий спосіб проб надалі слід готувати змішану пробу і використовувати її для дослідження.
Стерильний скляний посуд слід відкривати безпосередньо перед відбором проби води. Споласкувати посуд або торкатись будь-яких предметів пробкою або краями посуду забороняється!
3.2. Вода поверхневих та підземних водойм
(моря, водосховища, штучні та природні водойми,
озера, річки, артезіанські свердловини, криниці)
Дослідження води поверхневих та підземних водойм проводять переважно при виборі джерела для централізованого господарсько-питного водопостачання або для оцінки санітарного стану місць відпочинку (наприклад, пляжів) за епідеміологічними показниками.
При виборі поверхневих водойм як джерела централізованого водопостачання місця для відбору проб води намічають відповідно до ГОСТу 2761-84 "Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения".
При виборі підземних джерел водопостачання місця відбору проб намічають у відповідності з параграфом 3 того ж самого ГОСТу. Проби беруть 1-2 рази на місяць або за схемами, що розробляє санепідслужба з урахуванням санітарно-гігієнічної та епідемічної ситуації.
Відбір проб безпосередньо з берега річки або озера не бажаний.
Воду з відкритих водойм, криниць, калтажів тощо забирають вручну за допомогою батометра у стерильний посуд об'ємом 3 л. При відборі проб води поверхневих водойм використовують плавучі засоби, мости або помости. Проби відбирають з глибини 10-15 см від поверхні води, придонні проби - на рівні 30-50 см від дна. Об'єм однієї проби - 3 л.
Проби води підземних джерел (у тому числі артезіанських свердловин) відбирають після тривалого відкачування води до встановлення постійного динамічного рівня у стерильний посуд об'ємом 10 л. Це, як правило, відносно чиста вода, її використовують для водозбірних колонок та водопроводів, тобто це питна вода. Посуд наповнюють водою та щільно закривають стерильною гумовою пробкою або кришечкою.
3.3. Питна вода
Проби води централізованого водопроводу беруть для дослідження в розвідній водопровідній мережі відповідно вимогам Державних санітарних правил і норм "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання", затверджених наказом МОЗ України від 23.12.96 N 383.
Питну воду відбирають безпосередньо в стерильний посуд без застосування гумових (латексних) шлангів, водорозподільчих сіток або насадок. Перед відбором проб кран кінцевої ділянки периферійної водопостачальної мережі (або відвідний кран на етапі обробки води на водозабірних спорудах) тричі фламбують запаленим спиртовим факелом і спускають воду впродовж 10-15 хв. при повністю відкритому крані.
Якщо через відповідний кран вода тече постійно, то відбір проб води проводиться без фламбування запаленим спиртовим факелом, без змін напору води або у самій конструкції крану.
Об'єм однієї проби - 10 л.
Для нейтралізації залишків хлору в посуд для відбору проб перед стерилізацією додають гіпосульфіт натрію з розрахунку 20 мг на 1 л води!
4. Підготовка проб до дослідження
4.1. Обробка проб стічних вод
Проби стічної води, відібрані за допомогою марлевих тампонів за Moore, обробляють за методом Ріордана. Для цього в поліетиленовий мішечок з тампоном додають 10 мл розчину Хенкса (рН 7,4), перемішують, декілька разів стискаючи мішечок ззовні, через 1-2 хв. тампон віджимають та викидають.
У віджатій рідині вимірюють рН та доводять до значень 8,0-8,4, використовуючи 1 М розчин NaOH або 1 М розчин HCl. Про значення рН судять за зміною кольору індикаторної смужки. Із загальної кількості віджатої рідини відбирають тільки 100 мл в стерильну широкогорлу центрифужну склянку та центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв.
У стерильну центрифужну склянку переносять 20,0-50,0 мл надосаду, заморожують і зберігають при температурі -20 град. С впродовж однієї доби.
Через добу надосад розморожують при +20 град. С і повторно центрифугують у тому самому режимі. Після центрифугування відбирають надосад у стерильний скляний посуд. Маркують. Зразок готовий для подальшого дослідження.
Проби стічної води, відібрані в стерильний скляний посуд, поміщають у холодильник або у холодну кімнату при температурі +4 град. С. Стічній воді дають відстоятися впродовж 30 хв. у доставленому посуді, потім верхній шар стічної рідини в об'ємі 1,0 л відливають і маркують. Зразок готовий для подальшого дослідження.
Якщо відібрані проби стічної води дуже сильно забруднені твердими відходами, фекаліями або каламутні і мають майже чорний колір, то для прискорення осідання цих домішок проби попередньо центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. або фільтрують через простерилізований фільтр, виготовлений з фільтрувального паперу або вати. Надосад або освітлений фільтрат відбирають в об'ємі 1 л та використовують для подальшого дослідження.
Доцільно половину проби стічної води використати для концентрування в ній вірусу, а другу половину зберігати як резерв при температурі +4 град. С до успішного завершення етапів концентрування та індикації вірусу.
4.2. Обробка води поверхневих та підземних водойм
Проби води, відібрані в стерильний посуд і доставлені в лабораторію, поміщають у холодильник або у холодну кімнату при температурі +4 град. С, дають відстоятися впродовж 30 хв. у доставленому посуді, а потім верхній шар води в об'ємі 2,0 л відливають і використовують для подальшого дослідження.
4.3. Обробка питної води
Проби питної води в об'ємі 10 л, відібрані в стерильний посуд і доставлені в лабораторію, поміщають у холодильник або холодну кімнату при температурі +4 град. С, дають відстоятися впродовж 30 хв. у доставленому посуді, а потім вдаються до дехлорування (див. Розділ 3.3).
Проби води, звільнені від хлору, використовують для подальшого дослідження.
5. Методи концентрації вірусів у пробах води
Методи, що застосовують для концентрації вірусів у пробах води, повинні відповідати таким вимогам: можливість концентрувати малу або навіть незначну кількість патогенних для людини вірусів, наявних у великих об'ємах води; забезпечувати відокремлення вірусів від бактерій та інших контамінантів; сконцентрований вірусний матеріал має зберігати життєздатність для подальшого вірусологічного дослідження.
Методи концентрації вірусів з води можна умовно поділити на групи:
- фізичні (ультрацентрифугування, фільтрація, ультрафільтрація, пінна флотація, електрофорез та електроосмос);
- фізико-хімічні (осадження за допомогою сульфату амонія, сульфату алюмінія, концентрація поліетиленгліколем, двохфазний метод із застосуванням ПЕГ 6000 та декстрану Т40 Amersham-Pharmacia та ін.);
- адсорбційні (адсорбція на марлевих тампонах, активованому вугіллі, природних мінеральних сорбентах - бентоніті, асканіті та ін., на іоно-обмінних смолах, аміноетоксиаеросилі, поліметилксилоксані, макро-пористому склі, двохфазний метод та ін.).
Вибір методу концентрації вірусів у пробах води залежить від багатьох чинників: ступеня забруднення води, чутливості методики, доступності стандартизованого адсорбенту, наявності відповідного обладнання (наприклад, ультрацентрифуг з охолодженням або спеціального обладнання для ультрафільтрації) та навантаження на лабораторію.
Санітарно-вірусологічний моніторинг за забрудненням води (стічної, поверхневих та підземних водойм, питної), як правило, в практичних лабораторіях проводиться за кількома показниками (ентеровіруси, ротавіруси, аденовіруси, віруси гепатиту А, коліфаги), тому доцільно використовувати такий спосіб концентрації і використовувати єдиний реактив для концентрації, який би дозволяв визначати декілька показників вірусів одномоментно.
Усі роботи, пов'язані з концентрацією та виділенням вірусів, здійснюються за умови дотримання правил безпеки (при роботі зі збудниками III-IV групи патогенності) у повній відповідності до регламентуючих документів (див. Список використаних джерел).
5.1. Концентрація вірусів методом фільтрації
через фільтр з матеріалу Петрянова
Фільтр з матеріалу Петрянова (далі ФП) фіксують у будь-якому утримувачі фільтру, прикладаючи до решітки тою чи іншою його стороною, оскільки обидві поверхні фільтру ідентичні. Діаметр ФП може дорівнювати 3-14 см.
Досліджувану пробу води, що попередньо пройшла обробку (див. Розділ 4), пропускають під тиском через фільтрувальну установку або спеціальну насадку з утримувачем фільтру. Після проходження всієї досліджуваної проби води через фільтр та адсорбції на ньому вірусів його видаляють стерильним пінцетом із утримувача і вміщують у стерильну чашку Петрі.
Для елюції вірусу з поверхні фільтру на нього наносять 1 М розчин NaCl (елюент) з розрахунку 2,0 мл на 10 кв.см поверхні фільтра, тобто 2 мл рідини на фільтр діаметром 3 см. Фільтр промивають, піпетуючи рідину впродовж 2-3 хв., а далі рідину зливають у флакон і отримують елюат I. Процедуру елюції вірусів з фільтру повторюють, елюати I і II об'єднують.
Недоліком методу є швидке засмічення пор фільтру та неповна десорбція вірусу з його поверхні.
5.2. Концентрація вірусів методом осадження
за допомогою алюмінія сульфату
Температуру попередньо обробленої проби води доводять до +20 +- 1 град. С на водяній бані чи за допомогою термостату. До 1 л води додають 2 мл 10% розчину алюмінія сульфату (Al (SO ) ), ретельно перемішують, рН води краплинами доводять до 2 4 3
значень 5,4-5,8. Для цього застосовують 1 М розчин HCl або 1 М розчин NaOH.
Досліджувану пробу (рН 5,4-5,8) із внесеним в неї розчином алюмінія сульфату витримують при температурі +18-20 град. С впродовж 4 годин, або при температурі +4 град. С - впродовж 18 годин. Прозорий надосад обережно зливають та викидають, а білий аморфний осад, що містить у собі віруси, переносять у центрифужну склянку або пробірку і центрифугують при 2000 об./хв. впродовж 10-15 хв. Надосад знову видаляють, а осад, що став більш щільним, суспендують у 4,0 мл розчину Хенкса (рН 7,4) для елюції вірусів і знову центрифугують за вказаних вище умов. Для подальшого дослідження відбирають вже надосад (елюат), в якому міститься сконцентровані віруси, а осад алюмінія сульфату, звільнений від вірусу, викидають.
В якості елюентів, окрім розчину Хенксу (рН 7,4), можна використовувати 0,5 М фосфатний буфер (рН 8,2) та ін.
Проби води, оброблені солями алюмінію, зберігають тільки при температурі +4 град., ні в якому разі не заморожуючи їх.
5.3. Концентрація вірусів за допомогою
гідрогелю метилкремнієвої кислоти
Дослідження починають з підготовки гідрогелю метилкремнієвої кислоти (далі ГГМКК), що випускається вітчизняним виробником ЗАТ "Екологоохоронна фірма "КРЕОМА-ФАРМ", м. Київ, N Р/П Р.11.02/05576.
В основі методу лежить принцип фізичної адсорбції кремнійорганічною матрицею ПМС рота-, ентеро-, кишкових аденовірусів людини, ВГА з проб води. Пориста структура ГГМКК характеризується стабільним складом, питомою сорбційною поверхнею 100-150 кв.м/г, сумарним об'ємом пор 2,7-3,0 см/г, радіусом пор понад 100 нм, високою ефективністю адсорбції ротавірусів (70-75 нм), ентеровірусів (28-30 нм), ВГА (27-30 нм), аденовірусів 40 та 41 типів (80-90 нм). Використовують дрібнодисперсну форму ГГМКК.
ГГМКК попередньо розфасовують по 1 г та по 20 г для зручності використання.
ГГМКК у пробу води додають з розрахунку 1,0 г на 0,5 л.
Концентрація вірусів у пробах стічної води: досліджувані проби води доводять до температури 20 +- 1 град. С, рН води від'юстовують до значення 5,0, додаючи краплинами 1 М розчин HCl.
До 0,5 л освітленої та підкисленої проби стічної води додають 1,0 г Ентеросгелю, ретельно та енергійно струшують вручну (4-5 хв.) або струшують автоматично впродовж 10-20 хв.
Проби води із внесеним Ентеросгелем розливають у стерильні центрифужні склянки або скляні флакони (зручно використовувати флакони з-під поживних середовищ для культури клітин або з-під трипсину для культур клітин об'ємом 250 мл чи 500 мл) та центрифугують при 1000 об./хв. впродовж 10-20 хв. або відстоюють 14-16 годин. Білий осад, який утворився, є дуже легким, не щільним, тому надосадову рідину обережно зливають через край, залишаючи на дні склянки або флакону не тільки осад, а ще й надосад (загальний об'єм 20 мл). Цей залишок струшують і переносять в дві центрифужні пробірки та повторно центрифугують за вказаних вище умов. Після повторного центрифугування осад щільно формується на дні пробірки, а надосад легко видаляють пастерівською піпеткою або дозатором і в роботі більше не використовують.
До отриманого осаду, що являє собою осаджений комплекс "вірус-ГГМКК", у кожну центрифужну пробірку додають 2,0 мл 0,05 М трис-буферу з рН 8,4 для елюції вірусу з часточок ГГМКК, легко струшують вручну та залишають при кімнатній температурі на 4-5 хв. Потім центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Відбирають у стерильні пробірки надосад (елюат), що є концентратом вірусів (загальний об'єм 4 мл), і використовують для подальшого дослідження.
В якості елюентів, окрім 0,05 М трис-буферу з рН 8,4, можна використовувати 0,05 М фосфатний буфер, рН 8,4.
Процес концентрації вірусів з проб займає загалом не більше 1,5-2,0 годин.
Схема концентрації вірусів ГГМКК у пробах стічної води надана у табл. 6.1.
Таблиця 6.1.
Схема концентрації вірусів ГГМКК
у пробі стічної води
------------------------------------------------------------------
| Етап | Матеріал | Обробка | Тривалість |
| | | | етапу |
|---------+--------------+--------------------------+------------|
|Адсорбція|Проба стічної |- Додати 1 М HCl до рН 5,0| 20-40 хв. |
|вірусів |води (500 мл) |- Додати 1 г ГГМКК | |
|на ГГМКК | |- Струшувати 10-20 хв. | |
| | |- Центрифугувати | |
| | | при 1000 об./хв. | |
| | | впродовж 10-20 хв. | |
| | |- Відібрати надосад | |
| | |- Надосад в подальшій | |
| | | роботі | |
| | | не використовувати! | |
| |--------------+--------------------------+------------|
| |Нещільний |- Струшувати впродовж | До 30 хв. |
| |білий осад | 4-5 хв. і перенести | |
| |після | в 2 центрифужні | |
| |центрифугуван-| пробірки | |
| |ня (20 мл) |- Центрифугувати при | |
| | | 2000-3000 об./хв. | |
| | | впродовж 10-20 хв. | |
| | |- Відібрати надосад | |
| | |- Надосад в подальшій | |
| | | роботі | |
| | | не використовувати! | |
|---------+--------------+--------------------------+------------|
|Елюція |Осад після |- Додати 2,0 мл у кожну | До 30 хв. |
|вірусів |центрифугуван-| пробірку 0,05 М | |
|з ГГМКК |ня | трис-буферу (рН 8,4); | |
| | |- Струсити та залишити | |
| | | при кімнатній | |
| | | температурі впродовж | |
| | | 4-5 хв.; | |
| | |- Центрифугувати при | |
| | | 2000-3000 об./хв. | |
| | | впродовж 10-20 хв. | |
| | |- Відібрати надосад - | |
| | | елюат (4 мл) | |
|---------------------------------------------------+------------|
| Елюат (4 мл) використовують для подальшого | Загальні |
| дослідження |затрати часу|
| |1,5-2,0 год.|
------------------------------------------------------------------
Концентрація вірусів у пробах води поверхневих (відкритих) або підземних водойм: досліджувані проби води доводять до температури 20 +- 1 град. С, рН води від'юстовують до значення 5,0, додаючи краплинами 1 М розчин HCl.
До 1 л досліджуваної проби додають 2,0 г ГГМКК. При роботі з 2 л води відповідно вносять 4,0 г ГГМКК.
Проби води із внесеним ГГМКК розливають у стерильні центрифужні склянки або скляні флакони на 500 мл та центрифугують при 1000 об./хв. впродовж 10-20 хв. Білий осад, який утворився, є дуже легким, не щільним, тому надосадову рідину обережно зливають через край, залишаючи на дні склянки або флакону осад. Загальний об'єм осаду має не перевищувати 20 мл! Осад струшують і переносять в дві центрифужні пробірки та повторно центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Після повторного центрифугування осад щільно формується на дні пробірки, а надосад легко видаляють і в роботі більше не використовують.
До отриманого осаду, що являє собою комплекс "вірус-ГГМКК", в кожну центрифужну пробірку додають 2,0 мл 0,05 М трис-буферу з рН 8,4 для елюції вірусу з часточок Ентеросгелю, легко струшують вручну та залишають при кімнатній температурі на 4-5 хв. Потім центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Відбирають у стерильні пробірки надосад (елюат), що є концентратом вірусів (4 мл), і використовують для подальшого дослідження.
Схема концентрації вірусів Ентеросгелем у пробах води поверхневих (відкритих) або підземних водойм надана у табл. 6.2.
Таблиця 6.2.
Схема концентрації вірусів ГГМКК
у пробі води поверхневих (відкритих)
та підземних водойм
------------------------------------------------------------------
| Етап | Матеріал | Обробка | Тривалість |
| | | | етапу |
|---------+---------------+-------------------------+------------|
|Адсорбція|Проба води |- Додати 1 М р-н HCl до | До 40 хв. |
|вірусів |(2000 мл) | рН 5,0 | |
|на ГГМКК | |- Додати 4 г ентеросгелю | |
| | |- Струшувати 10-20 хв. | |
| | |- Центрифугувати при | |
| | | 1000 об./хв. впродовж | |
| | | 10-20 хв. | |
| | |- Відібрати надосад | |
| | |- Надосад в подальшій | |
| | | роботі | |
| | | не використовувати! | |
| |---------------+-------------------------+------------|
| |Нещільний білий|- Струшувати впродовж | До 30 хв. |
| |осад після | 4-5 хв. і перенести | |
| |центрифугування| у 2 центрифужні | |
| |(20 мл) | пробірки | |
| | |- Центрифугувати при | |
| | | 2000-3000 об./хв. | |
| | | впродовж 10-20 хв. | |
| | |- Відібрати надосад | |
| | |- Надосад в подальшій | |
| | | роботі | |
| | | не використовувати! | |
|---------+---------------+-------------------------+------------|
|Елюція |Осад після |- Додати 2,0 мл у кожну | До 30 хв. |
|вірусів з|центрифугування| пробірку 0,05 М | |
|ГГМКК | | трис-буферу (рН 8,4) | |
| | |- Струсити та залишити | |
| | | при кімнатній | |
| | | температурі | |
| | | впродовж 4-5 хв. | |
| | |- Центрифугувати | |
| | | при 2000-3000 об./хв. | |
| | | впродовж 10-20 хв. | |
| | |- Відібрати надосад - | |
| | | елюат (4 мл) | |
|---------------------------------------------------+------------|
|Елюат (4 мл) направляють для подальшого дослідження| Загальні |
| | затрати |
| | часу |
| |1,5-2,0 год.|
------------------------------------------------------------------
Концентрація вірусів у пробах питної води: проби води попередньо звільняють від хлору, доводять до температури 20 +- 1 град. С, рН води і доводять до значення 5,0, додаючи краплинами 1 М розчин HCl.
До проби водопровідної води/питної води об'ємом 10-20 л додають відповідно 20-40 г ГГМКК, який вносять безпосередньо у скляний посуд.
Не застосовуйте ГГМКК, якщо проба води знаходиться у металевому бідоні! Це утруднює відокремлення його від надосаду!
Для ефективної адсорбції вірусів Ентеросгелем, пробу струшують вручну або автоматично. Утворений комплекс "вірус-ГГМКК" осаджують шляхом відстоювання при температурі +4 град. С впродовж 14-18 годин. Так, наприклад, якщо проби води доставлені до лабораторії у другій половині або наприкінці робочого дня, то після вказаної вище підготовки та обробки ГГМКК вони можуть бути залишені для седиментації осаду до ранку при кімнатній температурі 20 +- 1 град. С. Далі надосад обережно зливають через край, залишаючи на дні скляного посуду 200 мл нещільного білого осаду. Цей залишок (осад + невелика кількість надосаду) струшують і переносять у центрифужні стакани або флакони на 250 мл та центрифугують при 1000 об./хв. впродовж 10-20 хв. Білий осад, який утворився після центрифугування, є ще також ще не досить щільним, тому надосадову рідину обережно зливають через край, залишаючи на дні флакону близько 20 мл. Цей залишок струшують і переносять в дві центрифужні пробірки та повторно центрифугують за тим самим режимом. Після повторного центрифугування осад щільно формується на дні пробірок, а надосад легко видаляють пастерівською піпеткою або дозатором і в роботі більше не використовують.
До отриманого осаду, що являє собою осаджений комплекс "вірус-ГГМКК", в кожну центрифужну пробірку додають по 2,0 мл 0,05 М трис-буферу з рН 8,4 для елюції вірусу з часточок ГГММКК, легко струшують вручну та залишають при кімнатній температурі на 4-5 хв. Потім центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Відбирають у стерильні пробірки надосад (елюат), що є концентратом вірусів (4 мл), і використовують для подальшого дослідження.
Схема концентрації вірусів ГГМКК у пробах питної води надана у табл. 6.3.
Таблиця 6.3.
Схема концентрації вірусів ГГМКК
у пробі питної води
------------------------------------------------------------------
| Етап | Матеріал |Обробка | Тривалість |
| | | | етапу |
|----------+--------------+-------------------------+------------|
|Адсорбція |Проба питної |- Додати 1 М р-н HCl до |До 20 год. |
|вірусів на|води (10 л) | рН 5,0; | |
|ГГМКК |після |- Додати 20 г ГГМКК | |
| |дехлорування |- Струшувати автоматично | |
| | | 10-20 хв. або вручну до| |
| | | 5 хв. | |
| | |- Відстоювання | |
| | | при кімнатній | |
| | | температурі 14-18 годин| |
| | |- Надосад обережно злити | |
| | | через край | |
| | |- Надосад в подальшій | |
| | | роботі | |
| | | не використовувати! | |
| |--------------+-------------------------+------------|
| |Нещільний |- Центрифугувати при |До 30 хв. |
| |білий осад | 1000 об./хв. впродовж | |
| |після | 10-20 хв. | |
| |відстоювання |- Відібрати надосад | |
| |впродовж | Надосад в подальшій | |
| |14-18 год | роботі | |
| |(200 мл) | не використовувати! | |
| |--------------+-------------------------+------------|
| |Нещільний |- Струшувати впродовж |До 30 хв. |
| |білий осад | 4-5 хв. і перенести | |
| |після | в 2 центрифужні | |
| |центри- | пробірки; | |
| |фугування |- Центрифугувати при | |
| |(20 мл) | 2000-3000 об./хв. | |
| | | впродовж 10-20 хв. | |
| | |- Відібрати надосад | |
| | |- Надосад в подальшій | |
| | | роботі | |
| | | не використовувати! | |
|----------+--------------+-------------------------+------------|
|Елюція |Осад після |- Додати 2,0 мл у кожну |До 30 хв. |
|вірусів з |центри- | пробірку 0,05 М | |
|ГГМКК |фугування | трис-буферу (рН 8,4); | |
| | |- Струсити та залишити | |
| | | при кімнатній | |
| | | температурі впродовж | |
| | | 4-5 хв.; | |
| | |- Центрифугувати | |
| | | при 2000-3000 об./хв. | |
| | | впродовж 10-20 хв.; | |
| | |- Відібрати надосад - | |
| | | елюат (4 мл) | |
|---------------------------------------------------+------------|
| Елюат (4 мл) направляють для подальшого | Загальні |
| дослідження |затрати часу|
| | до 24 год. |
------------------------------------------------------------------
5.4. Концентрація вірусів за допомогою бентоніту
Метод широко застосовувався в Україні для дослідження води на ентеровіруси. Концентрація ентеровірусів за допомогою бентоніту детально описана в методичних рекомендаціях "Применение бентонита для выявления энтеровирусов у человека и во внешней среде", Київ, 1986.
Принцип методу концентрації полягає в адсорбції бентонітом ентеровірусів у кислому середовищі (рН 4,0-5,0) з подальшою елюцією вірусів трис-буфером з лужним значенням рН (8,5-9,5)
Елюції ентеровірусів з бентоніту перешкоджають в лужному середовищі катіони. Тому комплекс "бентоніт-вірус" попередньо відмивають (знесолюють) дистильованою водою в кислому середовищі, а потім процес елюції здійснюють у невеликому об'ємі в лужному середовищі.
Схема концентрації вірусів з проб води бентонітом представлена у табл. 6.4.
Таблиця 6.4.
Схема концентрації вірусів із проб води бентонітом
------------------------------------------------------------------
| Етап | Матеріал | Обробка |Тривалість |
| | | | етапу |
|------------+---------------+-----------------------+-----------|
|Адсорбція |Проба стічної |- Додати NaCl (3,0) до |До 20 хв. |
|вірусів |води (250 мл) | 0,1 М концентрації; | |
|на бентоніті| |- Додати 5% гель | |
| | | бентоніту; | |
| | |- Додати 1 М р-н HCl | |
| | | до рН 4,5-5,0; | |
| | |- Струшувати 4-5 хв., | |
| | |- Центрифугувати при | |
| | | 1000 об./хв. | |
| | | впродовж 7-10 хв. | |
|------------+---------------+-----------------------+-----------|
|Відмивання |Осад після |- Додати 10-15 мл |До 20 хв. |
|від залишків|центрифугування| дистильованної води; | |
|солі (NaCl) | |- Струсити впродовж | |
| | | 4-5 хв.; | |
| | |- Центрифугувати | |
| | | при 3000 об./хв. | |
| | | впродовж 10-15 хв. | |
|------------+---------------+-----------------------+-----------|
|Елюція |Осад після |- Додати 2,0 мл 0,05 М |До 30 хв. |
|вірусів з |центрифугування|трис-буферу (рН 9,0); | |
|бентоніту | |- Струсити впродовж | |
| | | 4-5 хв.; | |
| | |- Центрифугувати при | |
| | | 3000 об./хв. впродовж| |
| | | 15-20 хв. | |
| | |- Відібрати надосад - | |
| | | елюат N 1 (2,0 мл) | |
| |---------------+-----------------------+-----------|
| |Осад після |- Додати 2,0 мл 0,05 М |До 30 хв. |
| |центрифугування| трис-буферу (рН 9,0);| |
| | |- Струсити впродовж | |
| | | 4-5 хв.; | |
| | |- Центрифугувати при | |
| | | 3000 об./хв. впродовж| |
| | | 15-20 хв. | |
| | |- Відібрати надосад - | |
| | | елюат N 2 (2,0 мл) | |
|----------------------------------------------------+-----------|
| Елюати N 1 та N 2 об'єднати в одну пробу | Загальні |
| (4,0 мл) для подальшого дослідження |втрати часу|
| | до 2 год. |
------------------------------------------------------------------
Метод характеризується високою ефективністю, його можна застосовувати для концентрації вірусів з води будь-якого ступеня забрудненості. До недоліків методу відноситься відсутність стандартизованого препарату 5% геля бентоніту.
5.5. Деконтамінація вірусного концентрату
Щоб видалити з вірусних концентратів супровідну мікрофлору (деконтамінувати), матеріал обробляють етиловим ефіром, хлороформом або антибіотиками. Деконтамінацію проводять у випадку, коли вірусний концентрат вносять на культуру клітин з метою виділення та ідентифікації виділеного агенту.
У разі обробки етиловим ефіром його додають до концентрату (проби) у співвідношенні 1 : 1, ретельно перемішують, герметично закривають гумовими пробками і залишають при температурі +4 град. С на 18-24 годин. Утворюються два шари рідини з кільцем жирової субстанції. Піпеткою відбирають водну фазу з дна флакону або пробірки у стерильні чашки Петрі або флакони з ватно-марлевими пробками, залишають у витяжній шафі до повного випаровування ефіру.
За умови обробки антибіотиками до вірусного концентрату додають 200-1000 Од/мл пеніциліну і 200-500 мкг/мл стрептоміцину, після чого витримують при кімнатній температурі 1-2 години. Для досягнення максимального ефекту обидва способи можна поєднувати.
6. Алгоритми санітарно-вірусологічного
дослідження води
6.1. Стічні води
Дослідження стічної води на наявність патогенних для людини вірусів здійснюють, дотримуючись всіх етапів санітарно-вірусологічного дослідження: відбір проб води, підготовка проб (освітлення та попередня очистка води), концентрація вірусів у пробах; вірусологічне дослідження. Проби відбирають в об'ємі 0,5-1,0 л. Підготовка проб до дослідження, а саме освітлення та попередня очистка води проводиться з урахуванням методу забору проб води (див. Розділ 4).
Для концентрації вірусів у пробах стічної води доцільно застосовувати:
1) метод фільтрації крізь фільтри Петрянова (ФП),
2) метод марлевих тампонів за Moore,
3) адсорбційний бентонітовий метод,
4) метод адсорбції на аеросилі,
5) метод адсорбції на ГГМКК.
Кожний з цих методів має свої позитивні сторони та недоліки. Наприклад, простий та доступний метод марлевих тампонів використовують як для первинного виділення вірусів з потоку стічних вод (метод пасток), так і для первинної концентрації вірусів з доставленої в лабораторію води. Проте цей метод поряд з його технічною простотою та доступністю має меншу ефективність та обмеженість через неможливість стандартизації адсорбенту.
Недоліком методу фільтрації крізь ФП є швидке засмічення пор фільтру та неповна десорбція вірусу з його поверхні. Найбільший досвід в Україні надбано при застосуванні адсорбційних методів концентрації вірусів з проб води. Найкраще зарекомендував себе адсорбційний метод із застосуванням природного сорбенту бентоніту.
Зважаючи на нові вимоги щодо стандартизації адсорбенту, на кафедрі вірусології НМАПО імені П.Л. Шупика розроблено новий метод концентрації вірусів із застосуванням стандартизованого препарату ГГМКК. До позитивних аспектів застосування "ГГМКК" можна віднести ефективність концентрації вірусів (у 50-100 разів), вітчизняне виробництво, доступність, можливість придбання у широкій аптечній мережі будь-якого міста України та низьку собівартість дослідження.
Для концентрації вірусів у пробах стічної води можуть бути використані ще інші методи. Так, наприклад, для виявлення поліовірусів рекомендації ВООЗ ("Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде") дають принципову характеристику двом методам:
1) методу двохфазного розділення із застосуванням двох полімерів - декстрану Т40 та ПЕГ 6000;
2) методу адсорбції на макропористому склі.
Алгоритм дослідження стічних вод представлено на рис. 7.1.
-----------------------------
| Відбір проби стічної води |
| 1 л (0,5 л) |
-----------------------------
v
-----------------------------
| Прояснення та очищення |
-----------------------------
v
-----------------------------
| Концентрація вірусів |
-------------------------------------------------
v v v v
-------------- -------------- -------------- ----------------
| Фільтрація | |Адсорбція на| |Адсорбція на| |Метод марлевих|
| крізь ФП | | ГГМКК | | бентоніті | | тампонів |
-------------- ------------------------------ ----------------
| v v |
| ----------------------------- |
--------->| Концентрат |<----------
-----------------------------
v v
----------------------------- -----------------------------
| Індикація вірусів | | Деконтамінація |
----------------------------- -----------------------------
v v
----------------------------- -------------- ---------------
| ПЛР, | | У культурі | | Виділення та|
| ІФА, | | клітин | <-|ідентифікація|
| ІХА, | -------------- | виділеного |
| РНГА, | -------------- | агенту |
| ЕМ | |На тваринах | <-| |
----------------------------- -------------- ---------------
Рис. 7.1. Алгоритм санітарно-вірусологічного дослідження
стічної води
6.2. Вода поверхневих та підземних водойм
Дослідження води відкритих (поверхневих) та підземних водойм на наявність патогенних для людини вірусів здійснюють, дотримуючись всіх етапів санітарно-вірусологічного дослідження. Проби відбирають в об'ємі 3,0 л. Оскільки проби води відбирають у скляний посуд, то на етапі підготовки до дослідження, воді дають просто відстоятися при температурі +4 град. С впродовж 30 хв., а потім поверхневий шар води в об'ємі 2,0 л відбирають для подальшої обробки - концентрації вірусів (див. Розділ 5).
Для концентрації вірусів у пробах води відкритих (поверхневих) та підземних водойм доцільно застосовувати:
1) метод фільтрації крізь фільтри Петрянова (ФП),
2) адсорбційний бентонітовий метод,
3) метод адсорбції на ГГМКК,
4) метод осадження сульфатом алюмінію.
Алгоритм дослідження води відкритих (поверхневих) та підземних водойм представлено на рис. 7.2.
-----------------------------
| Вода поверхневих і |
| підземних водойм (3 л) |
-----------------------------
v
-----------------------------
| Прояснення та очищення |
-----------------------------
v
-----------------------------
| Концентрація вірусів |
-------------------------------------------------
v v v v
-------------- -------------- -------------- ----------------
| Фільтрація | |Адсорбція на| |Адсорбція на| | Осадження |
| крізь ФП | | ГГМКК | | бентоніті | | сульфатом |
-------------- ------------------------------ | алюмінію |
| | | ----------------
| v v |
| ----------------------------- |
--------->| Концентрат |<----------
-----------------------------
v v
----------------------------- -----------------------------
| Індикація вірусів | | Деконтамінація |
----------------------------- -----------------------------
v v
----------------------------- -------------- ---------------
| ПЛР, | | У культурі | | Виділення |
| ІФА, | | клітин | <-| вірусів та |
| ІХА, | -------------- |ідентифікація|
| ЕМ, | -------------- | виділеного |
| РНГА | |На тваринах | <-| агенту |
----------------------------- -------------- ---------------
Рис. 7.2. Алгоритм санітарно-вірусологічного дослідження проб
води поверхневих і підземних водойм
6.3. Питна вода
Дослідження питної води (центрального водопостачання та інших видів) проводять у великих об'ємах - 10 л. У цьому випадку завдання ускладнюється тим, що віруси можуть знаходитись у питній воді значного об'єму у дуже малій кількості. Тому при виборі методу концентрування вірусів з проб питної води важливо враховувати метод забору проб води (через шланги, або безпосередньо у бутилі чи в бідони, чи в інший спосіб), умови транспортування, зручність методу при роботі з великими об'ємами. При дослідженні водопровідної питної води обов'язковим є введення етапу дехлорування натрієм гіпосульфіту з розрахунку 20 мг на 1 л води, або можна застосовувати 15% стерильний розчин тіосульфату натрію із розрахунку 2 мл на кожний 1 л води.
Для концентрації вірусів у пробах питної води доцільно застосовувати:
1) метод адсорбції за допомогою іонообмінних смол АВ-17-8, АВ-17-6, АВ-17НК;
2) адсорбційний аеросіл;
3) осадження ПЕГ 6000;
4) метод адсорбції на ГГМКК;
5) ультрафільтрація.
Алгоритм дослідження питної води представлено на рис. 7.3.
-----------------------------
| Питна вода (10 л) |
-----------------------------
v
-----------------------------
| Дехлорування |
-----------------------------
v
-----------------------------
| Концентрація вірусів |
-------------------------------------------------
v v v v
-------------- -------------- -------------- --------------
|Адсорбція на| |Адсорбція на| | Осадження | |Адсорбція на|
|іонообмінних| | бентоніті | | ПЕГ-6000 | | ГГМКК |
| смолах | ------------------------------ --------------
-------------- | | |
| v v |
| ----------------------------- |
--------->| Концентрат |<----------
-----------------------------
v v
----------------------------- -----------------------------
| Індикація вірусів | | Деконтамінація |
----------------------------- | вірусовмісного матеріалу |
| -----------------------------
v v
----------------------------- -------------- ---------------
| ПЛР, | | У культурі | | Виділення |
| ІФА, | | клітин | <-| вірусів та |
| ІХА, | -------------- |ідентифікація|
| ЕМ, | -------------- | вірусного |
| РНГА | |На тваринах | <-| агенту |
----------------------------- -------------- ---------------
Рис. 7.3. Алгоритм санітарно-вірусологічного дослідження
питної води
При концентрації вірусів за допомогою бентоніту чи ГГМКК до проб водопровідної/питної води об'ємом 10-20 л відповідно вносять 2,5-5 мл 5% гелю бентоніту чи 20-40 г ГГМКК.
Не застосовуйте ГГМКК, якщо проба води знаходиться у металевому бідоні! Це утруднює відокремлення його від надосаду!
7. Методи дослідження проб води на наявність вірусів
7.1. Дослідження проб води на наявність ротавірусів
Ротавіруси (РВ) людини у пробах води виявляють після етапу концентрації, застосовуючи методи індикації вірусних антигенів або геномної РНК за допомогою готових наборів/тест-систем. У деяких випадках визначення геномної РНК РВ можливе без попереднього етапу концентрації безпосередньо у відібраних пробах.
Найбільш доступними для практичної вірусологічної лабораторії методами виявлення РВ є ІФА, РНГА та ІХА. Інші методи виявлення РВ - електронна мікроскопія, полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією - зазвичай більш складні у виконанні, вимагають значних фінансових ресурсів (для придбання високовартісного обладнання, тест-систем, реактивів, підготовки приміщення тощо) та відповідної підготовки персоналу лабораторій.
7.1.1. Імуноферментний аналіз
Імуноферментний аналіз (далі ІФА) - високочутливий та специфічний метод, відносно простий у виконанні, дозволяє досліджувати одночасно велику кількість зразків, використовуючи повністю або частково автоматизовані системи: рідер, вошер, термостат тощо. Тривалість дослідження - 4 години. Результат оцінюється якісно як "позитивний" або "негативний".
Особливості підготовки проб води та концентратів (елюатів) для дослідження методом ІФА. Доцільно застосовувати ІФА після проведення етапу концентрації РВ з проб води і в якості зразків вносити на плашку елюат (концентрат РВ), попередньо відновивши рН до нейтральних значень.
Деконтамінацію елюатів ефіром або антибіотиками перед постановкою ІФА не проводити!
Тест-системи для виявлення РВ наведені в табл. 8.1.
Таблиця 8.1.
Тест-системи комерційні для ІФА,
призначені для виявлення ротавірусів людини
при проведенні епіднагляду
------------------------------------------------------------------
| Тест-система | Виробник | Форма |Кількість |
| | | випуску |досліджень|
|---------------+--------------------------+----------+----------|
|Premier |Meridian Diagnostics Inc.,|12 стрипів| 48 |
|Rotaclone |USA |з лунками | |
|---------------+--------------------------+----------+----------|
|Abbott Testpack|Abbott Laboratories, USA |Окремі | 20 |
| | |пробірки | |
|---------------+--------------------------+----------+----------|
|Pathfinder |Sanofi Diagnostics |Окремі | 50 |
| |Pasteur, France |диски | |
|---------------+--------------------------+----------+----------|
|IDEIA |Dako Diagnostics Ltd., |12 стрипів| 96 |
| |United Kindom |з лунками | |
|---------------+--------------------------+----------+----------|
|Рота-аналіз |ЗАО "Біоімуноген", Росія |12 стрипів| 96 |
| | |з лунками | |
------------------------------------------------------------------
Примітка. У таблиці наведені не всі існуючі тест-системи,
а тільки найбільш відомі і доступні. Тест-системи не зареєстровані
в Україні і ввозяться за разовим дозволом. При застосуванні слід
точно дотримуватися інструкції виробника.
7.1.2. Імунохроматографічний аналіз
Доцільним і своєчасним є впровадження в практику роботи вірусологічних лабораторій простих у виконанні, дешевих, чутливих та специфічних тестів, що сконструйовані за принципом імунохроматографічного аналізу (ІХА).
ІХА-тести для виявлення РВ - швидкі, безпечні та зручні у застосуванні. Їх випускають багато фірм-виробників, їх рекомендує до впровадження ВООЗ, "Cito test Rota", виробництва CerTest Biotec. S.L. Іспанія (ТОВ "Фармаско"), та тести "RotaStick", виробництва Novamed Ltd, Ізраїль (ТОВ "Дніпроінвест") зареєстровані в України. Відносна чутливість більшості швидких ІХА-тестів дорівнює 99%, відносна специфічність - близько 98%.
Механізм тестування полягає у наступному: під час тестування зразок наносять на мембрану тесту або сам тест занурюють у досліджуваний зразок. Якщо в досліджуваному матеріалі-елюаті є РВ, то відбувається специфічна імунологічна реакція між РВ і комплексом, який заздалегідь нанесений та висушений на мембрані тесту (антиротавірусні моноклональні антитіла + червоні мікросфери колоїдного золота). Утворений новий комплекс (вірус + моноклональні антитіла + червоні мікросфери колоїдного золота), мігрує вздовж мембрани під дією капілярної сили. У випадку позитивного результату, специфічні поліклональні антитіла, які присутні на мембрані в зоні "Т", будуть захоплювати забарвлене сполучення та утворювати червону смугу в зоні "Т". Просуваючись далі вздовж мембрани до зони "К" (контрольної ділянки тесту) рідина, що вже звільнилась від специфічного імунного комплексу, проявляє лінію зеленого кольору. Наявність зеленої смуги слугує внутрішнім контролем тесту і підтвердженням достатньої кількості використаного зразку, повноти заповнення капілярів мембрани та відповідної якості реагентів. В разі позитивного результату з'являються дві смуги: чітка червона лінія на білій центральній зоні "Т" та чітка зеленої смуга в контрольній зоні.
Особливості підготовки проб води та концентратів (елюатів) для дослідження методом ІХА. Тест проводять відразу після етапу концентрації ротавірусів у пробі води. Деконтамінацію елюатів ефіром або антибіотиками перед постановкою ІХА не проводити!
Перед проведенням дослідження значення рН зразків (концентратів) від'юстувати до нейтральних.
Проведення дослідження. Розпакувати тест при кімнатній температурі. Пристроєм, що додається до тесту, або дозатором внести 5 крапель (125 мкл) отриманого концентрату (елюату) у зону Т (тестова зона). Тест залишити на при кімнатній температурі на 5-10 хв. відповідно до інструкції. Облік результатів проводять через 5-10 хв. візуально.
7.1.3. Електронна мікроскопія
Методи електронної мікроскопії є "золотим стандартом" в діагностиці РВІ і дозволяють швидко та надійно ідентифікувати ротавіруси за характерною морфологією, тобто як такі, що нагадують своїм виглядом колесо дитячої машинки (така морфологія вірусу віддзеркалена у назві від лат. Rota - колесо) і мають розміри 70-75 нм. Проте такі дослідження в Україні можливі лише у спеціалізованих лабораторіях, що оснащені електронними мікроскопами.
Деконтамінацію елюатів ефіром або антибіотиками перед дослідженням методами електронної мікроскопії не проводити! Не заморожувати і не розморожувати матеріал!
Проведення дослідження. На опірну сітку, покриту вуглеводно-формваровою плівкою-підкладкою, наносять краплю елюату і залишають на 5-10 хв. За цей час вірус адсорбується на гідрофільній поверхні плівки-підкладки. Надлишок рідини видаляють смужкою фільтрувального паперу, торкаючись краю предметної сітки. Після цього на сітку наносять краплину контрастуючої рідини. Через 30-40 с надлишок вологи видаляють за допомогою фільтрувальної смужки. В якості контрастуючих речовин використовують водні розчини 3% молібдату амонію (рН 7,0), 3% фосфорно-вольфрамову кислоту (рН 6,5-6,8), 1% уранілформіату.
Підсушену сітку досліджують під електронним мікроскопом, наприклад ЕМ-125К, вакуумний універсальний пост ВУП-5 виробництва Україна, м. Суми при інструментальному збільшенні 30-60 тис., продивляючись 40-50 секторів сітки. Належність виявлених часток до ротавірусів визначають за розміром та характерною морфологією.
7.1.4. Реакція непрямої гемаглютинації
Принцип РНГА полягає в тому, що попередньо оброблені формаліном або таніном еритроцити (найчастіше барана), на поверхні яких сорбовані специфічні антитіла (сенсибілізовані еритроцити), у присутності гомологічного антигену утворюють агрегати, що проявляється феноменом аглютинації. Метод високочутливий (виявляє 1-2 нг білку) і специфічний (більше 93%). Метод досить простий у виконанні, не потребує складного обладнання та апаратури і може бути виконаний у будь-якій вірусологічній лабораторії!
До складу тест-систем для РНГА входять, як правило, три компоненти: 1) еритроцитарний діагностикум (ЕД) рідкий, що являє собою 1% суспензію еритроцитів барана, сенсибілізованих імуноглобуліновою фракцією асцитної рідини білих щурів, імунізованих ротавірусом мавп SA-11; 2) імунна асцитна рідина (ІАР) білих щурів, імунізованих ротавірусом мавп SA-11; 3) антиген ротавірусу мавп SA-11 (АГ).
Особливості підготовки проб води та концентратів (елюатів) для дослідження методом РНГА з ротавірусним діагностикумом "Ротатест", виробництва Ростов-на-Дону: дослідження проводять відразу після етапу концентрації ротавірусів у пробі води. Деконтамінацію елюатів ефіром або антибіотиками перед постановкою ІХА не проводити!
Перед проведенням дослідження значення pH зразків (концентратів) ад'юстувати до нейтральних.
Проведення дослідження. Реакцію проводять в мікропланшетах для імунологічних реакцій в об'ємі 75 мкл. В кожну лунку двох рядів мікропланшета вносять по 25 мкл досліджуваного зразку (елюату). По 25 мкл додають в перші лунки вказаних рядів, після чого готують його послідовні дворазові розведення (від 1:2 до 1:256). Далі в лунки першого ряду додають по 25 мкл 0,9% розчину NaCl, а в лунки другого ряду - по 25 мкл ІАР. Планшет струшують та залишають при кімнатній температурі на 20 хв. для утворення комплексу антигену з антитілом в лунках другого ряду. Після цього в усі лунки вносять по 25 мкл ЕД. Планшет знову струшують і залишають на 1,5-2 годин для специфічної взаємодії АГ ротавірусу з ЕД.
Реакція супроводжується такими контролями:
- контроль неспецифічної аглютинації ЕД (в 3 лунки вносять по 50 мкл 0,9% розчину NaCl та додають по 25 мкл ЕД в кожну);
- контроль специфічної взаємодії ЕД та ІАР. Його виконують по вище описаній методиці РНГА, використовуючи АГ ротавірусу мавп SA-11, який входить до складу тест-системи. Цей контроль проводять після отримання комплекту, а потім - у разі необхідності.
Облік результатів в контролях: в першому контролі спонтанна аглютинація ЕД повинна бути відсутня. В контролі специфічної взаємодії ЕД та ІАР в першому ряду ЕД повинен реагувати з антигеном в розведенні не менш ніж 1:256, а в другому ряду ІАР повинна знижувати титр АГ не менше ніж в 4 рази.
Позитивним вважають результат у випадку повного гальмування аглютинації в другому ряду РНГА не менше ніж на 2 розведення (в 4 рази) в порівнянні з першим рядом.
Постановка контролів є обов'язковою при одержанні нової тест-системи!
7.1.5. Полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією
Проведення дослідження можливе за умов наявності певного набору приміщень, що відповідають "Правилам функціонального устрою та експлуатації приміщень лабораторії молекулярно-генетичних досліджень", згідно до методичних вказівок "Застосування полімеразної ланцюгової реакції для виявлення збудників інфекційних захворювань людини" (МВ 9.9.5.101-203, Київ, 2003), високо вартісного обладнання та діагностичних наборів.
Метод ПЛР зі зворотною транскрипцією (транскриптазно опосередкована ампліфікація) включає етапи:
1) виділення вірусної РНК з досліджуваного матеріалу (проби води, концентрат вірусу, елюат після концентрації),
2) зворотну транскрипцію вірусспецифічної ДНК на матриці вірусної РНК,
3) ампліфікацію послідовностей цієї ДНК та детекцію одержаних ампліфікатів методом електрофорезу у агарозному гелі або ПААГ.
Для проведення дослідження використовують сертифіковані на Україні тест-системи.
Матеріал для дослідження: неконцентровані проби води та концентрат вірусів.
Ефективність виявлення ротавірусів вища після концентрації методом адсорбції на ГГМКК!
Перед дослідженням проби зберігають при температурі +2-8 град. С не більше одної доби, тривало - при температурі мінус 70 град. С. Допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу.
Проведення аналізу
Етап 1. Виділення РНК проводиться в кімнаті для обробки матеріалу (Зона 1).
Порядок роботи
1. Лізуючий розчин і розчин для відмивання 1 (якщо вони зберігалися при 2-8 град. С) прогріти при 60-65 град. С до повного розчинення кристалів.
2. Відібрати необхідну кількість одноразових пробірок на 1,5 мл з кришкою, що щільно закривається (включаючи негативний і позитивний контролі виділення). Внести в кожну пробірку 5 мкл внутрішнього контрольного зразка (ВКО Rotavirus-rec), потім по 450 мкл лізуючого розчину. Промаркірувати пробірки.
3. В пробірки з лізуючим розчином і ВКО внести по 100 мкл досліджуваних проб води або концентрату, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром. В пробірку негативного контролю (НК) виділення внести 100 мкл негативного контрольного зразка (НКЗ). В пробірку позитивного контролю (ПК) виділення внести 90 мкл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка (ПКЗ) Rotavirus-rec.
4. Щільно закриті проби ретельно перемішати на вортексі і центрифугувати впродовж 5 с при 5000 об./хв. на мікроцентрифузі для видалення крапель з внутрішньої поверхні кришки пробірки.
5. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. В кожну пробірку окремим наконечником додати по 25 мкл ресуспендованого сорбенту. Перемішати на вортексі, поставити в штатив на 1 хв., ще раз перемішати і залишити на 5 хв.
6. Центрифугувати пробірки для осадження сорбенту при 10 000 об./хв. впродовж 30 с на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
7. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
8. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 3. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. Ценрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
9. Повторити відмивання розчином для відмивання 3, дотримуючись пункту 8.
10. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 4. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Повністю видалити супернатант з кожної пробірки окремими наконечниками, використовуючи вакуумний аспіратор.
11. Помістити пробірки в термостат при +60 град. С на 5-10 хв. для підсушування сорбенту. При цьому кришки пробірок повинні бути відкритими.
12. В пробірки додати по 50 мкл РНК-елюента, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром, вільні від РНКаз. Перемішати на вортексі. Помістити в термостат при температурі +60 град. С на 2-3 хв. Перемішати на вортексі і центрифугувати пробірки на максимальних оборотах мікроцентрифуги (12 000-13 000 об./хв.) 1 хв.
Супернатант (надосад) містить очищені РНК. Проби готові до постановки реакції зворотної транскрипції і ПЛР.
Реакцію зворотної транскрипції слід проводити відразу після отримання РНК-проби. Відбирати розчин РНК для реакції потрібно дуже обережно, не захоплюючи сорбент. Якщо сорбент скаламутився, необхідно осадити його на центрифузі.
Очищена РНК може зберігатися при 2-8 град. С до 4 годин. Для тривалого зберігання препарату, необхідно, не захоплюючи сорбент, відібрати розчин РНК, перенести в стерильну пробірку і зберігати при мінус 70 град. С.
Етап 2. Постановка реакції зворотної транскрипції і проведення ПЛР проводиться в кімнаті для розкапування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації (Зоні 2).
Постановка реакції зворотної транскрипції (загальний об'єм реакції - 20 мкл, об'єм РНК-проби - 10 мкл).
Порядок роботи
При роботі з РНК необхідно використовувати тільки одноразові стерильні пластикові витратні матеріали, що мають спеціальне маркування "RNase-free", "DNase-free".
1. Відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,2 мл.
2. Приготувати реакційну суміш на 12 реакцій. Для цього в пробірку з ліофілізованим DTT додати 125 мкл RT-mix і ретельно перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.
3. До отриманого розчину додати 6 мкл ревертази, перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.
4. Внести в мікропробірки по 10 мкл готовій реакційній суміші.
5. Використовуючи наконечники з бар'єром, додати 10 мкл РНК-проби в пробірку з реакційною сумішшю. Обережно перемішати.
6. Поставити пробірки в ампліфікатор (термостат) при температурі +37 град. С на 30 хв.
7. Отриману в реакції зворотної транскрипції кДНК для подальшої постановки ПЛР розвести в 2 рази ДНК-буфером (до 20 мкл кДНК окремим наконечником додати 20 мкл ДНК-буфера).
Готовий препарат кДНК можна зберігати при температурі -20 град. С впродовж 1 тижня або при температурі -70 град. С протягом року.
Постановка ПЛР (загальний об'єм реакції - 25 мкл, об'єм кДНК-проби - 10 мкл).
Обов'язково застосовується "арячий старт", який забезпечується розділенням нуклеотидів і Taq-полімерази прошарком воску. Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при температурі +95 град. С, що значно знижує кількість неспецифічних реакцій.
Підготовка пробірок для проведення ПЛР:
1) відібрати необхідну кількість пробірок з ПЛР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб;
2) на поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЛР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЛР-сумішшю-1;
3) зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл).
Порядок роботи
1. Узяти підготовлені для ПЛР пробірки. Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл кДНК, отриманих в реакції зворотної транскрипції РНК:
позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ПКЗ кДНК;
негативний контроль ПЛР (К-) - внести в пробірку 10 мкл ДНК-буфера.
2. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (дивися інструкцію до набору):
3. Після закінчення реакції пробірки відправити до кімнати для аналізу продуктів ПЛР (Зону 3).
Проби після ампліфікації можна зберігати 16 годин при кімнатній температурі, впродовж тижня - при температурі 2-8 град. С.
Етап 3. Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР-ампліфікації - проводиться в кімнаті для аналізу продуктів ампліфікації (Зоні 3).
Порядок роботи
1. Пробірки з продуктами ампліфікації виставити в штатив послідовно, відібрати з-під шару масла по 10-15 мкл проб і внести в лунки гелю (якщо для нанесення різних проб використовується один і той самий наконечник, то її необхідно промивати буфером з камери після нанесення кожної проби). В кожному рядку доріжок гелю повинен бути обов'язково представлений К+.
2. Підключити камеру до джерела струму, дотримуючи полярність (ДНК рухається до позитивного електроду), і включити джерело (напруга 250-300 В, стабілізація по напрузі), час електрофорезу - 18-20 хв. Оптимальна напруженість електричного поля при цьому складає 10 В/см.
3. Після закінчення електрофорезу (барвник ксиленцианол при цьому пройде приблизно половину довжини гелю - 1,5 см), вимкнути джерело струму, перенести гель на трансілюмінатор. Отримати зображення гелю на комп'ютері за допомогою відеосистеми, відзначивши порядок нанесення, занести в базу даних.
Робота з ампліфікованими днк повинна проводитися в окремій кімнаті співробітником лабораторії, що не проводить маніпуляцій в Зоні 1 і Зоні 2.
Облік результатів ПЛР-аналізу проводиться за наявності або відсутності на електрофореграмі специфічних смуг ампліфікованої кДНК (рис. 8.1, табл. 8.2).
Рис.8.1. Облік результатів ПЛР-аналізу.
Таблиця 8.2.
Оцінка результатів ПЛР-аналізу
контрольних зразків
------------------------------------------------------------------
| Контрольний | Контрольований | Специфічні смуги на |
| зразок | етап | електрофореграмі |
| | ПЛР-аналізу |---------------------------------|
| | | Смуга 290 п.н. | Смуга 514 п.н.|
|-------------+----------------+-----------------+---------------|
|"ПК" |Виділення РНК | Є | Є |
|-------------+----------------+-----------------+---------------|
|"НК" |Виділення РНК | Ні | Є |
|-------------+----------------+-----------------+---------------|
|"К-" |ПЛР | Ні | Ні |
|-------------+----------------+-----------------+---------------|
|"К+" |ПЛР | Є | Ні |
------------------------------------------------------------------
1. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу виділення (ПК), повинні бути дві яскраві помаранчеві смуги, що світяться: специфічна - на рівні 290 п.н. і смуга внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ) - на рівні 514 п.н.
2. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу виділення (НК), повинна бути тільки смуга ВКЗ на рівні 514 п.н.
3. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу ПЛР (К+), повинна бути яскрава специфічна помаранчева смуга на рівні 290 п.н, що світиться.
4. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу ПЛР (К-) не повинне бути ніяких смуг.
5. Позитивними вважаються зразки, які містять специфічну смугу, що світиться, на рівні 290 п.н. більшої або меншої інтенсивності, незалежно від наявності смуги внутрішнього контролю.
6. Негативними вважаються зразки, які містять тільки смугу 514 п.н. більшої або меншої інтенсивності.
7. Окрім смуг 290 п.н. і 514 п.н. в доріжках можуть спостерігатися нечіткі розмиті смуги праймер-димерів, які розташовуються нижче за рівень 100 нуклеотидних пар.
Результати аналізу не підлягають обліку в наступних випадках:
1. Якщо результати аналізу контрольних зразків не співпадають з наведеними в таблиці, то відповідний етап аналізу слід переробити.
2. Якщо в доріжці будь-якої з проб відсутні обидві смуги, і 290 п.н. і 514 п.н., результат аналізу даної проби вважається недійсним, необхідно повторити дослідження із самого початку.
3. В доріжках з'являються неспецифічні смуги на різних рівнях. Можливі причини: відсутність "гарячого старту" або невірний температурний режим в осередках ампліфікатора.
4. Поява специфічної смуги 290 п.н. в будь-якому з негативних контрольних зразків (НК, К-) вказує на контамінацію реактивів або проб. В цьому випадку результати аналізу вважають недійсними. Необхідно повторити аналіз проб, а також вжити заходи щодо виявлення джерел контамінації.
7.2. Дослідження проб на наявність
аденовірусів 40-41 типів
Індикацію аденовірусів людини в елюатах, отриманих після концентрування, проводять методами електронної мікроскопії, в РНГА із специфічним рідким діагностикумом "Аденотест", ПЛР, ІХА.
Виділення та ідентифікацію аденовірусів з проб води здійснюють у культурі клітин.
7.2.1. Електронна мікроскопія
Єдиний метод лабораторного дослідження, який дозволяє візуально виявити та ідентифікувати аденовірус за морфологічними ознаками, проте найчастіше застосовується в умовах спеціалізованих вірусологічних лабораторій НДІ.
Для приготування препарату на предметну сітку, вкриту вуглецево-формваровою плівкою-підкладкою, наносять концентрат (елюат). Після негативного контрастування фосфорно-вольфрамовою кислотою препарати досліджують при інструментальному збільшенні у 30-50 тисяч разів (див. Розділ 8.1.3). Належність виявлених часток до аденовірусів визначають за характерною морфологією та розміром.
7.2.2. Реакція непрямої гемаглютинації
Використовують еритроцитарний аденовірусний імуноглобуліновий рідкий діагностикум для РНГА "АДЕНОТЕСТ" для виявлення і кількісного визначення титрів аденовірусів 40-41 типів.
До складу тест-системи "АДЕНОТЕСТ" входять три компоненти:
1) діагностикум еритроцитарний аденовірусний імуноглобуліновий рідкий (ЕД);
2) імунна асцитна рідина (ІАР);
3) антиген аденовірусів (АГ).
Реакцію проводять у мікропланшетах для імунологічних реакцій в об'ємі 75 мкл. В кожну лунку двох рядів мікропланшета вносять по 25 мкл стабілізованого 0,9% розчину NaCl. По 25 мкл концентрату, додають в перші лунки вказаних рядів, після чого готують його послідовні дворазові розведення (від 1:2 до 1:256). Далі в лунки першого ряду додають по 25 мкл 0,9% розчину NaCl, а в лунки другого ряду - по 25 мкл ІАР.
Планшет струшують та залишають при кімнатній температурі на 20 хв. для утворення комплексу антиген-антитіло в лунках другого ряду. Після цього в усі лунки вносять по 25 мкл ЕД. Планшет знову струшують і залишають на 1,5-2 годин для специфічної взаємодії АГ аденовірусу з антиаденовірусними імуноглобулінами ЕД.
Реакція супроводжується такими контролями:
- контроль неспецифічної аглютинації ЕД (в 3 лунки вносять по 50 мкл 0,9% розчину NaCl та додають по 25 мкл ЕД в кожну);
- контроль специфічної взаємодії ЕД та ІАР. Його виконують за вище описаною методикою РНГА, використовуючи замість досліджуваної проби АГ аденовірусу, який титрують від 1:64 до 1:2048. Антиген входить до складу тест-системи у розведенні 1:32. Цей контроль проводять після отримання комплекту, а потім - за необхідністю.
Облік результатів у контролях: у першому контролі спонтанна аглютинація ЕД повинна бути відсутня. УВ контролі специфічної взаємодії ЕД та ІАР в першому ряду ЕД повинен реагувати з антигеном в розведенні не менш ніж 1:256, а в другому ряду ІАР повинна знижувати титр АГ не менше ніж в 4 рази.
Позитивний результат на наявність аденовірусу дають у випадку повного гальмування аглютинації в другому ряду РНГА не менше ніж на 2 розведення (в 4 рази) в порівнянні з першим рядом.
Постановка контролів є обов'язковою при одержанні нової тест-системи. В разі їх невідповідності тест-система вважається непридатною для застосування.
7.2.3. Полімеразна ланцюгова реакція
ПЛР призначена для виявлення в пробах води або в концентраті (елюаті) фрагментів послідовностей ДНК-геному аденовірусу при багаторазовому збільшенні (ампліфікації) кількості цих фрагментів з подальшим ідентифікуванням їх відомими методами - молекулярною гібридизацією, електрофорезом у агарозному чи поліакриламідному гелі (ПААГ). Принцип реакції полягає у багаторазовому повторенні циклів синтезу вірус специфічної послідовності ДНК за допомогою термостабільного ферменту Tag ДНК-полімерази та двох специфічних затравок (праймерів).
Виявленння ДНК аденовірусів в пробах води методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)
Для проведення аналізу використовуються проби води без етапу концентрації вірусу та концентрат (елюат), отриманий після концентрування (див. Розділ 6). Цей зразок в кількості 0,5-1 мл переносять в пробірки типу "еппендорф", що вільні від РНКаз та ДНКаз.
Зберігають проби при 2-8 град. С не більше 1 доби, тривало - при мінус 70 град. С. Допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу.
Доставка проб здійснюється в спеціальному термоконтейнері з охолоджуючими елементами.
Проведення аналізу*
Опис етапів ПЛР-аналізу
ПЛР-аналіз складається з трьох етапів:
- виділення ДНК;
- ампліфікація ділянки ДНК - полімеразная ланцюгова реакція (ПЛР);
- електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР та облік результатів ПЛР-аналізу.
* Для проведення дослідження рекомендовано використовувати тест-системи, сертифіковані в Україні.
Етап 2. Постановка ПЛР (загальний об'єм реакції - 25 мкл, об'єм ДНК-проби - 10 мкл).
Проводиться в Зоні 2 - кімнаті для розпакування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації.
У всіх комплектах АмпліСенс для ампліфікації обов'язково застосовується "гарячий старт", який забезпечується розділенням нуклеотидів і Taq-полімерази прошарком воску. Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при 95 град. С, що значно знижує кількість неспецифічних реакцій.
Підготовка пробірок для проведення ПЛР
1. Відібрати необхідну кількість пробірок з ПЛР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб.
2. На поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЛР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЛР-сумішшю-1.
3. Зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл).
Порядок роботи
1. Узяти підготовлені для ПЛР стерильні одноразові пробірки на 0,5 (0,2) мл (плюс дві контрольні). Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл ДНК, виділеної з проб води/елюатів або контролів етапу виділення.
2. Додаткові пробірки призначаються для контролів етапу ПЛР (див. нижче):
а) негативний контроль (К-) замість ДНК-проби внести в підготовлену пробірку 10 мкл ДНК-буфера;
б) позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ДНК;
3. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (див. табл. 5.1).
Порядок роботи
1. Лізуючий розчин і розчин для відмивання 1 (якщо вони зберігалися при 2-8 град. С) прогріти при 60-65 град. С до повного розчинення кристалів.
2. Відібрати необхідну кількість одноразових пробірок на 1,5 мл з кришкою, що щільно закривається (включаючи негативний і позитивний контролі виділення). Внести в кожну пробірку по 300 мкл лізуючого розчину. Маркірувати пробірки.
3. В пробірки з лізуючим розчином внести по 100 мкл проб, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром. В пробірку негативного контролю (НК) виділення внести 100 мкл негативного контрольного зразка (НКЗ). В пробірку позитивного контролю (ПК) виділення внести 90 мкл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка (ПКЗ Adenovirus).
4. Щільно закрити проби, ретельно перемішати на вортексі і ценрифугувати впродовж 5 с при 5000 об./хв. на мікроцентрифузі для видалення крапель з внутрішньої поверхні кришки пробірки.
5. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. В кожну пробірку окремим наконечником додати по 25 мкл ресуспендованого сорбенту. Перемішати на вортексі, поставити в штатив на 1 хв., ще раз перемішати і залишити на 5 хв.
6. Центрифугувати пробірки для осадження сорбенту при 10 000 об./хв. протягом 30 с на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
7. Додати в пробірки по 300 мкл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, процентрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
8. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 2. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. Ценрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
9. Повторити відмивання розчином для відмивання 2, згідно з пунктом 8.
10. Повністю видалити супернатант з кожної пробірки окремими наконечниками, використовуючи вакуумний аспіратор.
11. Помістити пробірки в термостат 62 град. С на 5-10 хв. для підсушування сорбенту. При цьому кришки пробірок повинні бути відкритими.
12. В пробірки додати по 50 мкл ТЕ-буфера для елюції ДНК, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром, вільні від РНКаз та ДНКаз. Перемішати на вортексі. Помістити в термостат 62 град. С на 2-3 хв. Перемішати на вортексі і центрифугувати пробірки на максимальних обертах мікроцентрифуги (12-13 000 об./хв.) впродовж 1 хв.
Супернатант містить очищені ДНК. Проби готові до постановки ПЛР.
Відбирати розчин ДНК для реакції потрібно дуже обережно, не захоплюючи сорбент.
Якщо сорбент скаламутився, необхідно осадити його центрифугуванням.
Очищена ДНК може зберігатися при 2-8 град. С до тижня. Для тривалого зберігання препарату, необхідно, не захоплюючи сорбент, відібрати розчин ДНК, перенести в стерильну пробірку і зберігати при мінус 70 град. С.
Етап 2. Постановка ПЛР (проводиться в Зоні 2 - кімнаті для розкапування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації; загальний об'єм реакції - 25 мкл, об'єм кДНК-проби - 10 мкл)
Обов'язково застосовується "гарячий старт". Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при 95 град. С, що значно знижує кількість неспецифічних реакцій.
Підготовка пробірок для проведення ПЛР:
1) відібрати необхідну кількість пробірок з ПЦР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб;
2) на поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЦР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЦР-сумішшю-1;
3) зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл).
Порядок роботи
1. Взяти підготовлені для ПЦР стерильні одноразові пробірки на 0,2 мл (плюс дві контрольні). Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл ДНК, виділеної з проб або контролів етапу виділення.
2. Додаткові пробірки призначаються для контролів етапу ПЛР:
а) негативний контроль (К-) замість ДНК-проби внести в підготовлену пробірку 10 мкл ДНК-буфера;
б) позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ДНК;
3. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (див. Інструкцію до тест-системи).
Етап 3. Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР-ампліфікації (проводиться в зоні 3 - кімнаті для аналізу продуктів ампліфікації).
Робота з ампліфікованими ДНК повинна проводитися в окремій кімнаті співробітником лабораторії, що не проводить маніпуляцій в Зоні 1 і Зоні 2.
Порядок роботив
1. Пробірки з продуктами ампліфікації виставити в штатив послідовно, відібрати з-під шару масла по 10-15 мкл проб і внести в лунки гелю (якщо для нанесення різних проб використовується один і той самий наконечник, то її необхідно промивати буфером з камери після нанесення кожної проби). В кожному ряді доріжок гелю повинен бути обов'язково представлений К+.
2. Підключити камеру до джерела струму, дотримуючи полярність (ДНК рухається до позитивного електроду), і включити джерело (напруга 250-300 В, стабілізація по напрузі), час електрофорезу - 18-20 хв. Оптимальна напруженість електричного поля при цьому складає 10 В/см.
3. Після закінчення часу електрофорезу (фарбник ксіленціанол при цьому пройде приблизно половину довжини гелю - 1,5 см), вимкнути джерело струму, перенести гель на трансілюмінатор. Отримати зображення гелю на комп'ютері за допомогою відеосистеми, відзначивши порядок нанесення, занести в базу даних.
При дослідженні гелю і фотографуванні очі повинні бути захищені спеціальною маскою або скляною пластиною!
Облік результатів
Облік результатів ПЛР-аналізу проводиться по наявності або відсутності на електрофореграмі специфічних смуг амплифікованої кДНК (табл. 8.3, рис. 8.2).
Таблиця 8.3.
Оцінка результатів ПЛР-аналізу
контрольних зразків
------------------------------------------------------------------
| Контрольний |Контрольований | Специфічні смуги на |
| зразок | етап | електрофореграмі |
| | ПЛР-аналізу |----------------------------------|
| | | Смуга 462 п.н. |
|-------------+---------------+----------------------------------|
|"ПК" |Виділення ДНК | Є |
|-------------+---------------+----------------------------------|
|"НК" |Виділення ДНК | Ні |
|-------------+---------------+----------------------------------|
|"К-" |ПЛР | Ні |
|-------------+---------------+----------------------------------|
|"К+" |ПЛР | Є |
------------------------------------------------------------------
Рис. 8.2. Електрофореграмма результатів тестування зразків на наявність ДНК Adenovirus
Довжина специфічних смуг амплифікованих фрагментів кДНК: аденовірусу - 462 п.н.
1. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу виділення (ПК), повинні бути дві яскраві оранжеві смуги, що світяться: специфічна - на рівні 462 п.н.
2. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу виділення (НК), не повинно бути смуг.
3. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу ПЛР (К+), повинна бути яскрава специфічна оранжева смуга на рівні 462 п.н., що світиться.
4. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу ПЛР (К-) не повинно бути ніяких смуг.
5. Позитивними вважаються зразки, які містять специфічну смугу, що світиться, на рівні 462 п.н. більшої або меншої інтенсивності.
6. Негативними вважаються зразки, які не містять ніяких смуг
7. Окрім смуг 462 п.н. в доріжках можуть спостерігатися нечіткі розмиті смуги праймер-димерів, які розташовуються нижче за рівень 100 нуклеотидних пар.
Результати аналізу не підлягають обліку в наступних випадках:
1. Якщо результати аналізу контрольних зразків не співпадають з приведеними в табл. 5.3, то відповідний етап аналізу слід переробити.
2. В доріжках з'являються неспецифічні смуги на різних рівнях. Можливі причини: відсутність "гарячого старту" або невірний температурний режим в осередках ампліфікатора.
3. Поява специфічної смуги 462 п.н. в будь-якому з негативних контрольних зразків (НК, К-) вказує на контамінацію реактивів або проби. В цьому випадку результати аналізу вважають недійсними. Треба повторити аналіз проб, а також вжити заходам по виявленню джерела контамінації.
7.2.4. Імунохроматографічний аналіз
ІХА-тести засновані на тих самих принципах імунологічних реакцій, застосуванні таких самих імунобіологічних продуктів, що і добре відомі класичні ІФА тест-системи. Але твердим носієм імунокомпонентів є НЦМ. Їм притаманна висока чутливість та специфічність.
Принцип комбінованого тесту "CITO TEST ROTA-ADENO". Тест побудований на використанні унікальної комбінації кон'югатів моноклональних антитіл проти аденовірусу та ротавірусу з частками барвника - колоїдного золота. В тесті використовуються також антиаденовірусні та антиротавірусні поліклональні антитіла, які вибірково зв'язуються з вірусами у пробі.
Механізм тестування полягає у наступному: під час проходження досліджуваної проби крізь адсорбуючу зону тестового приладу мічений кон'югат зв'язуються з аденовірусами у пробі, утворюючи синю смугу у тест-зоні. За наявності у пробі ротавірусів формується рожева або червна смуга. Компоненти тесту, які не вступили в реакцію, забезпечують виявлення зеленої смуги у контрольній зоні, що свідчить про функціонально активний стан реагентів та правильне проведення тесту. Процедура тесту: ІХА-тест в упаковці та досліджувані проби води або концентрат перед початком тестуванням витримують при кімнатній температурі. Тест виконують методом занурення - тримаючи тест на вертикально, занурюють білим кінцем тесту в зразок, не перевищуючи обмеження занурення, вказаного на тесті стрілками. Облік результату тесту проводиться через 10 хв. без подальшого втручання (рис. 8.3.).
Рис. 8.3. Постановка та облік результатів в ІХА-тесті "CITO TEST ROTA-ADENO", виробництва CerTest S.L. Іспанія (ТОВ "Фармаско")
Інтерпретація результату
Негативний результат: лише одна смуга зеленого кольору (контрольна лінія) з'являється на білій центральній ділянці тесту (контрольна ділянка тесту).
Позитивний результат: в доповнення до зеленої контрольної смуги також з'являється одна чітка червона смуга або одна чітка синя смуга або обидві смуги одночасно (лінія результату) на білій центральній зоні тесту (ділянка результату тесту). Наявність червоної і зеленої смуги свідчать про виявлення ротавірусів. Наявність синьої та зеленої смуги - про виявлення аденовірусів. Наявність трьох смуг (червоної, синьої та зеленої) - про одночасне виявлення двох збудників (ротавірусу та аденовірусу).
Тест недійсний: відсутність контрольної зеленої смуги незалежно від появи чи відсутності результативної лінії (червоної або синьої). Недостатня кількість зразку, неправильна техніка виконання тесту чи псування реагентів є вірогіднішими причинами відсутності контрольної лінії.
Інтенсивність синьої та червоної лінії на тестовій ділянці тесту залежить від концентрації вірусів, присутніх в досліджуваному зразку.
7.2.5. Виділення та ідентифікація виділеного агенту в культурі клітин
Аденовіруси можуть культивуватися на багатьох типах культур клітин. Для їх виділення у лабораторній практиці частіше використовуються перещеплювані лінії клітин епітелію людини (HeLa, HEp-2, КВ, L-41) і рідше - клітини приматів (Vero та інші). Найбільшу чутливість до аденовірусів мають первинні або диплоїдні культури клітин нирок ембріону людини. При їх використанні цитопатогенний ефект (ЦПД) проявляється набагато швидше, ніж у перщеплюваних культур клітин, тобто на 2-4 добу після інфікування. Час появи ЦПД залежить від типу вірусу та його концентрації. Ознаками ЦПД, що вказують на наявність аденовірусів у інфікованих чутливих культурах клітин, є округлення клітин, збільшення зернистості у цитоплазмі, формування скупчень клітин різних розмірів, які іноді нагадують виноградні грона. Моношар також може нагадувати сітку з розтягнутими вічками.
Для вирощування культур клітин використовують середовище росту, яке складається з 90% мінімального середовища Ігла (на розчині Ерла) і 10% телячої ембріональної сироватки.
Для підтримки культур клітин використовують мінімальне середовище Ігла (на розчині Ерла) з 2% телячої ембріональної сироватки. Проте, при спостеріганні за інфікованими клітинами кожні 4-5 діб потрібна заміна середовища на нове.
При необхідності зберігання матеріалів до двох тижнів для виділення аденовірусів їх поміщають у транспортне середовище Лейбовиця (NaCl - 4 г; KCl - 0,2 г; K2HPO4 - 1,7 г; деревне (бактеріологічне) вугілля - 10 г; агар - 4 г). Сольові компоненти розчиняють у 500,0 мл дистильованої води і додають вугілля. Агар також розчиняють у 500,0 мл дистильованої води. Змішують обидва розчини і автоклавують при 121 град. С (1 атм.). Суміш переносять в стерильну колбу з магнітом і перемішують на магнітному змішувачі поки температура не знизиться до 40 град. С, далі розливають по 8,0 мл в пробірки з нагвинчуючимися пробками.
При тривалому зберіганні зразків проб (більше двох тижнів) їх заморожують при температурі 15-30 град. С.
Вищезазначене транспортне середовище слід використовувати при зберіганні матеріалів при температурі + 2 - +8 град. С.
При виділенні аденовірусів із проб, відібраних із об'єктів довкілля, проводять роботу у такій послідовності:
- змінюють середовище росту на підтримуючи у пробірочній культурі клітин з суцільним моношаром;
- проби матеріалів вносять по 0,2 мл в 2-3 пробірки, в яких попередньо замінили середовище росту на середовище підтримки;
- після інфікування пробірки з культурою клітин поміщають в термостат при температурі 37 град. С, витримують протягом 7 діб та мікроскопують з однодобовим інтервалом.
При відсутності ЦПД при інфікуванні культур клітин доцільне проведення двох "сліпих" пасажів.
Ідентифікують та типують виділені у культурі клітин аденовіруси за допомогою типоспецифічних сироваток у реакції нейтралізації (РН) та реакції гальмування гемаглютинації (РГГА) згідно з інструкцією виробника щодо використання.
Індикацію аденовірусного антигену в культурах інфікованих клітин можна здійснювати одним з вищенаведених методів (див. пункти 7.2.2-7.2.4).
7.3. Дослідження проб на наявність ентеровірусів
7.3.1. Виділення вірусів у культурі клітин
Клітинні лінії, що рекомендуються для виділення ентеровірусів. Поліо- та інші ентеровіруси добре розмножуються в багатьох перещеплюваних клітинах людини і приматів - RD, HeLa, HEp-2, KB та ін. Проби, в яких передбачається присутність поліовірусу, слід перевіряти на двох лініях клітин - L20B і RD.
L20B - лінія мишачих клітин (L-клітин), яким генно-інженерним шляхом надана здатність експресувати рецептор до поліовірусу.
Клітини L20B чутливі до поліовірусів і викликають в них характерний цитопатичний ефект (ЦПД). Деякі віруси (зокрема, аденовіруси і реовіруси) можуть викликати ЦПД в цих клітинах, проте він значно відрізняється від того, що викликається поліовірусом. Небагато неполіомієлітних ентеровірусів (наприклад, Коксаки А) можуть розмножуватися в клітинах L20B (іноді тільки після культивування на іншій лінії клітин) і викликати типову для ентеровірусів ЦПД.
RD - клітини, одержані з рабдоміосаркоми людини. Використання цих двох ліній для лабораторної діагностики поліомієліту забезпечує високу чутливість і специфічність при виявленні поліовірусу, допомагає стандартизувати методику і порівнювати результати, одержані в різних лабораторіях.
У клітинах НЕр-2 розмножуються поліовіруси і віруси Коксаки В, викликаючи ЦПД.
Важливо стежити за чутливістю клітин до поліовірусів, періодично проводячи титрування референс-штамів вакцинних поліовірусів. Необхідно уникати контамінації мікоплазмами, змінюючи робочу лінію клітин після кожних 15 пасажів або тримісячного використання, новою порцією клітин з лабораторного банку. Контаміновані мікоплазмами клітинні матеріали знищують автоклавуванням.
Виділення поліовірусів та інших ентеровірусів
Для виділення поліо- та інших ентеровірусів потрібно приготувати:
- пробірки з культурою клітин L20B, RD та НЕр-2;
- підтримуюче середовище (ПС);
- піпетки на 1 і 5 мл.
Роботу з виділення ентеровірусів проводять у такій послідовності:
- мікроскопують культури з недавно сформованим моношаром для перевірки стану клітин; нормальний моношар формується протягом 2-3 днів після посіву клітин;
- видаляють середовище росту (СР) і замінюють його 1 мл ПС;
- маркірують по 2 пробірки кожного виду зазначених вище чутливих культур клітин для інокуляції матеріалами проб;
- маркірують по 1 пробірці з кожним типом клітин як негативні контролі;
- пробірки з різними видами клітин інокулюють одночасно;
- у кожну пробірку вносять по 0,2 мл досліджуваного матеріалу і інкубують у стаціонарному положенні з кутом нахилу 5 град. при 36 град. С;
- щодня мікроскопують культури, стежачи за появою ЦПД;
- щоденно реєструють результати спостережень за інокульованими і контрольними пробірками - розвиток ЦПД (1+ - до 25%, 2+ - 25-50%, 3+ - 50-75%, 4+ - 75-100%). Якщо розвивається швидка дегенерація клітин протягом одного-двох днів після інокуляції, це може свідчити про токсичність проби. Пробірки з дегенерацією клітин заморожують при -20 град. С, відтаюють і по 0,2 мл рідини вносять у культури клітин того ж самого типу. Якщо ознаки токсичності з'являються знову, повертаються до підготовленої до дослідження проби, розводять її у фосфатно-сольовому буфері (ФСБ) 1:10 та інокулюють культури, як описано вище.
Контамінація середовища і загибель клітин під впливом бактерій роблять виявлення вірусного ЦПД неможливим. У цьому випадку потрібно повернутися до початкового екстракту проби, повторно обробити його хлороформом і інокулювати культури, як описано вище.
При появі характерної для ентеровірусів ЦПД - закруглені, заломлюючі світло клітини, що відшаровуються від ростової поверхні, продовжують інкубацію до розвитку ЦПД в 75% клітин (3 + ЦПД) і зберігають пробірку при -20 град. С для другого пасажу. Матеріал другого пасажу використовують для типування вірусу і проведення внутрішньотипової диференціації (ВТД).
У випадку, якщо ЦПД не виявилася протягом 7 днів, проводять один "сліпий" пасаж і спостерігають культури ще 7 днів. Вміст окремих пробірок одного пасажу не змішують, а інокулюють окремо.
Сліпий пасаж проводиться також тоді, якщо через 5-7 днів у дослідних і контрольних пробірках з'являються ознаки старіння клітин або дегенерації. Такі пробірки з матеріалом проби заморожують при -20 град. С, відтаюють і переносять по 0,2 мл культуральної рідини у пробірки зі свіжою культурою тих же клітин, спостерігають протягом 7-10 днів. При відсутності ЦПД результат дослідження вважають негативним.
Культури з негативним результатом спостерігають в цілому не менше 14 днів, після чого їх знищують.
При позитивному результаті (наявність ЦПД) у клітинах RD, але негативному в клітинах L20B після 14 днів спостереження проводять повторне пересівання на клітинах L20B. Деякі штами поліовірусів погано розмножуються в клітинах L20B у першому пасажі і не викликають чіткої ЦПД. У той же час, вони добре розмножуються в клітинах RD і при переносі цих ізолятів в клітини L20B викликають чітку ЦПД. Тому, щоб не втратити можливість виділення такого штаму поліовірусу, усі матеріали, які викликали ЦПД у клітинах RD, але були негативні в клітинах L20B, досліджуються повторно на L20B. Для цього по 0,2 мл культуральної рідини із пробірок з клітинами RD, де було виявлено ЦПД, переносять у пробірки з клітинами L20B.
Деякі проби можуть містити віруси, що викликають ЦПД у клітинах L20B, але не відносяться до ентеровірусів (наприклад, окремі реовіруси і аденовіруси). У багатьох випадках ЦПД, викликана ними, суттєво відрізняється від ЦПД, властивої ентеровірусам. Присутність у пробі такого агента реєструється. Деякі неполіомієлітні ентеровіруси викликають ЦПД в клітинах L20B, проте спроби ідентифікувати поліовірус у цих випадках слід робити, щоб виключити його присутність. При отриманні невизначених або таких, що важко інтерпретуються результатів типування виділених вірусів ізоляти слід направити для дослідження в Центральну лабораторію з діагностики поліомієліту.
Найбільшу увагу необхідно приділяти попередженню вірусної перехресної контамінації при інокуляції культур клітин при проведенні пасажів. Середовище з інокульованих пробірок не можна зливати через край, його видаляють піпеткою, а піпетки міняють після кожної процедури. Мікродозатори використовують тільки з наконечниками, що не утворюють аерозоль. Піпетками працюють обережно, щоб уникнути утворення аерозолю. Бризки і краплі негайно обробляють дезінфектантом.
Додаткові дослідження з метою виділення поліовірусу
Для достовірності негативних результатів виділення поліовірусу та інших ентеровірусів можуть бути проведені додаткові дослідження.
Додатковий пасаж. Матеріал інокульованої культури клітин заморожують і відтаюють для звільнення внутрішньоклітинного вірусу і переносять у пробірку з моношаром клітин. Використання "молодих" нормальних клітин сприяє розвитку чіткого ЦПД, непомітного після первинної інокуляції, особливо у випадках токсичності або бактеріальної контамінації проби. Не слід проводити більш одного додаткового пасажу (три пасажі всього), оскільки збільшується небезпека перехресної контамінації і отримання помилкового позитивного результату.
Адсорбція вірусу на клітинному моношарі. Із пробірок з культурою клітин видаляють середовище досліджуваного матеріалу, промивають клітини стерильним ФСБ, вносять по 0,2 мл екстракту проби і протягом 1 години при кімнатній температурі обережно похитують або обертають пробірки для рівномірного розподілу інокулята на моношарі клітин. Потім до кожної пробірки додають по 1 мл ПС. Цим методом можна виявити вірус у низьких концентраціях, понизити токсичність проби і прискорити появу ЦПД щонайменше на один день.
Недоліки методу включають збільшення можливості вірусної перехресної і бактерійної контамінації через додаткове відкриття пробірок з культурою клітин. Високий ризик перехресної контамінації при роботі з пробами, що містять вірус у великих концентраціях, не дозволяє використовувати цей метод для пересіву виділених вірусів.
Ідентифікація виділених поліовірусів мікрометодом
Для ідентифікації виділених штамів поліовірусів їх розведені суспензії змішують у рівних об'ємах з сироватками тварин, імунних до 1, 2 та 3 типів поліовірусів. Суміші вірусу і сироваток вносять до лунок планшета для мікронейтралізації і витримують 1 годину при 36 град. С, щоб антитіла зв'язалися з вірусом. Потім до сумішей додають суспензію клітин, поміщають у термостат і щодня перевіряють наявність ЦПД. Імунна сироватка, що затримує розвиток ЦПД, вказує на тип вірусу.
Підготовка імунних сироваток для типування поліовірусів
Розведення до робочих титрів імунних моноспецифічних поліклональних сироваток проводиться згідно з інструкцією виробника щодо їх використання.
Суміші розливають у флакончики для заморожування з гвинтовими кришками і зберігають при -20 град. С. Моновалентні імунні сироватки, що залишилися, зберігають так само і використовують для підтвердження типу окремих штамів вірусу і приготування нових партій сумішей.
Нові серії сумішей перевіряють з вакцинними штамами поліовірусів типів 1, 2 і 3 на здатність ідентифікувати поліовіруси.
Тест нейтралізації для ідентифікації поліовірусів
Імунні сироватки з високими титрами антитіл змішують з 100 ЦПД50 виділеного штаму невідомого вірусу. Вірусна суспензія з пробірки з культурою, де відмічено 3+ - 4+ ЦПД, містить приблизно 105 -10М6 ЦПД50 в 50 мкл. У даному тесті використовують розведення 10-3 і 10-4 в цілях економії часу і матеріалів для попереднього титрування кожного штаму. Титрування штаму включають в кожен тест.
Якщо вірус виділений одночасно на клітинах RD та L20B, то штам, виділений на L20B, досліджують першим, щоб найбільш важливий результат отримати найшвидше. Якщо отриманий результат сумнівний, типують штам, виділений на клітинах RD. Штам, одержаний на L20B, направляють до Центральної лабораторії з діагностики поліомієліту для подальших досліджень.
Проведення реакції нейтралізації з метою ідентифікації поліовірусу
Потрібно приготувати:
- стерильні мікротитрувальні планшети культуральні 96-ти лункові з пласким дном та кришками;
- стерильні нетоксичні клеючі стрічки для планшетів (якщо використовують термостат без подачі CO2);
- стерильні пробірки місткістю 5 мл для розведень;
- одноразові пластикові піпетки на 1 мл і 2 мл;
- стерильні крапельниці на 50 мкл або мікродозатори з наконечниками, що не утворюють аерозоль (з фільтрами);
- флакон з культурою клітин, на яких був виділений вірус (зазвичай L20B).
- суміші антиполіовірусних сироваток;
- ПС.
Проводять роботу у такій послідовності:
- маркірують край мікротитрувального планшета, як вказано на рис. 8.4. (для двох штамів вірусу);
- вносять по 50 мкл кожної з 4 сумішей імунних сироваток в колонки 1-8 рядів від A до D (кожну суміш розливають окремою крапельницею або дозатором);
- додають по 50 мкл середовища в лунки контролю вірусу (від A9 до D10);
- додають по 50 мкл середовища в лунки титрування (від E1 до H10);
- додають по 100 мкл середовища в лунки контролю клітин (від G11 до H12) і закривають планшет;
- маркірують пробірки для розведень від 10-1 до 10-7, позначаючи пробірки кожного ряду номером проби (див. рис. 8.4);
- розливають по 0,9 мл середовища у пробірки 1-2 і 5-7 і по 1,9 мл середовища в пробірки 3 і 4;
Рис. 8.4. Схема планшету для ідентифікації поліовірусу
- додають 0,1 мл вірусної суспензії в першу пробірку (розведення 10-1) стерильною піпеткою або мікродозатором з наконечником з фільтром;
- іншою піпеткою (наконечником мікродозатора) ретельно і обережно перемішують вміст першої пробірки;
- переносять 0,1 мл у другу пробірку та змінюють піпетку (наконечник);
- продовжують розведення, переносячи по 0,2 мл в пробірки 3 і 4 (рис. 8.5.) і далі по 0,1 мл;
- тією ж самою крапельницею або мікродозатором розливають по 50 мкл кожного розведення вірусу N 1, починаючи від 10-7 до 10-3, у відповідні ряди титрування (колонки 1-10, ряди E і F);
Рис. 8.5. Титрування виділеного штаму поліовірусу
- вносять по 100 мкл суспензії клітин у дослідні та контрольні лунки;
- при культивуванні в термостаті без подачі CO2 кожен планшет заклеюють спеціальною нетоксичною плівкою;
- поміщають планшет в термостат при 36 град. С;
- щодня мікроскопують лунки планшету для виявлення ЦПД, результати реєструють;
- продовжують мікроскопування і облік результатів протягом 24 годин після того, як ЦПД в лунках контролю вірусу досягне 100% (зазвичай 3-5 днів).
При підготовці розведення вірусу потрібно пам'ятати про зміну піпеток або наконечників дозатора, щоб уникнути перенесення вірусу зовнішньою поверхнею кінчика піпетки або наконечника.
З Рисунками 8.1 - 8.5 можна ознайомитись: розділ "Довідники", підрозділ "Додатки до документів", папка "Накази".
Інтерпретація результатів
У лунках контролю клітин повинен бути суцільний клітинний моношар. У лунках контролю вірусу - повна ЦПД. Титрування повинне підтвердити, що використана в досліді кількість вірусу в кожному з розведень була в межах 32-320 ЦПД50 (тобто, титр вірусу складав 101,5 -102,5 /50 мкл, що відповідає 104,5 -106,5 у суспензії при виділенні вірусу). Результати тесту повинні оцінюватися за розведенням, яке відповідає справжньому титру вірусу в досліді. Якщо цей титр виходить за прийнятні значення, тест слід повторити з іншими розведеннями вірусу.
Суміш імунних сироваток, яка пригнічує розвиток ЦПД, вказує на тип вірусу або типи вірусів в суміші. Нездатність вірусу розмножуватися у присутності суміші імунних сироваток є результатом нейтралізації його інфекційності однією із сироваток, що входять в суміш.
На рис. 8.6. наведено типову схему ідентифікації виділеного поліовірусу на мікротитрувальному планшеті та інтерпретацію отриманих результатів.
Рис. 8.6. Ідентифікація виділеного штаму поліовірусу мікрометодом
З Рисунком 8.6 можна ознайомитись: розділ "Довідники", підрозділ "Додатки до документів", папка "Накази".
У табл. 8.4. представлені всі можливі комбінації наявності і відсутності ЦПД, які можуть спостерігатися в лунках мікротитрувального планшету з різними сумішами імунних сироваток, і наведена їх інтерпретація. Поява ЦПД, що іноді спостерігається після формування кінцевого результату, може пояснюватися дуже високою дозою вірусу, використаною в досліді, або присутністю другого вірусу в нижчій концентрації. Рекомендується перевірити суміш вірусів за допомогою монотипоспецифічних імунних сироваток.
Таблиця 8.4.
Інтерпретація результатів нейтралізації
при ідентифікації поліовірусу
------------------------------------------------------------------
| Поліо | Поліо | Поліо | Поліо | Ідентифікація |
| 1 + 2 + 3 | 1 + 2 | 1 + 3 | 2 + 3 | вірусу |
|-------------+---------+-----------+---------+------------------|
| 0 | 0 | 0 | + |Поліовірус типу 1 |
|-------------+---------+-----------+---------+------------------|
| 0 | 0 | + | 0 |Поліовірус типу 2 |
|-------------+---------+-----------+---------+------------------|
| 0 | + | 0 | 0 |Поліовірус типу 3 |
|-------------+---------+-----------+---------+------------------|
| 0 | 0 | + | + |Суміш поліовірусів|
| | | | | типів 1 і 2 |
|-------------+---------+-----------+---------+------------------|
| 0 | + | 0 | + |Суміш поліовірусів|
| | | | | типів 1 і 3 |
|-------------+---------+-----------+---------+------------------|
| 0 | + | + | 0 |Суміш поліовірусів|
| | | | | типів 2 і 3 |
|-------------+---------+-----------+---------+------------------|
| 0 | + | + | + |Суміш трьох типів |
| | | | | поліовірусів |
|-------------+---------+-----------+---------+------------------|
| + | + | + | + | Неполіомієлітний |
| | | | | вірус або суміш |
| | | | | поліовірусу |
| | | | | з іншим |
| | | | | ентеровірусом |
|----------------------------------------------------------------|
| + - наявність ЦПД 0 - відсутність ЦПД |
------------------------------------------------------------------
Підтвердження результатів типування поліовірусу
1. Збирають суспензію вірусу з відповідних лунок планшета, де проводилося типування.
2. Якщо планшет заклеєний листом, його не знімають, уникаючи перехресної контамінації, протирають 70% спиртом і проколюють над потрібною лункою стерильним наконечником. Не можна намагатися проколоти скляною піпеткою пластикову кришку планшета - скло може зламатися і травмувати оператора.
3. Готують розведення вірусної суспензії 1:10.
4. На мікротитрувальному планшеті для кожного вірусу, що перевіряється, розливають в 2 лунки по 50 мкл сироватки антиполіо-1 у 2 лунки по 50 мкл сироватки антиполіо-2 у 2 лунки по 50 мкл сироватки антиполіо-3 і в 2 лунки - по 50 мкл середовища росту для контролю вірусу.
5. Додають по 50 мкл розведеної суспензії вірусу в усі 8 лунок.
6. Витримують 1 годину при 37 град. С і додають по 100 мкл суспензії клітин.
7. Закривають (або заклеюють) планшет і витримують 24-48 годин при 36 град. С, реєструючи появу і розвиток ЦПД.
Поводження з виділеними вірусами
Усі поліовіруси повинні негайно направлятися до Центральної лабораторії з діагностики поліомієліту, яка проводить підтверджуючі дослідження та направляє матеріал для проведення внутрішньотипової диференціації поліовірусів до Регіональної референс-лабораторії ВООЗ.
Поява ЦПД в лунках, що містять усі комбінації імунних сироваток (нижній ряд таблиці), можлива у двох випадках. 1) Виділений вірус не є поліовірусом, а відноситься до ентеровірусів, аденовірусів або інших вірусів. 2) Виділена суміш поліовірусу з іншим вірусом. Оскільки виявлення поліовірусу є пріоритетним завданням, вірус, виділений у клітинах L20B, повинен бути направлений щонайшвидше до Центральної лабораторії з діагностики поліомієліту для подальшого дослідження.
Ідентифікація неполіомієлітних ентеровірусів (НПЕВ)
Із введенням у практику клітинної лінії L20B відпала необхідність проводити нейтралізацію ентеровірусів для виключення маскування ними поліовірусу в змішаній культурі.
На даний час для типування НПЕВ користуються сумішами імунних сироваток. Розведення до робочих титрів імунних сироваток проводиться у відповідності до інструкції виробника з їх використання.
Тест нейтралізації для ідентифікації ентеровірусів мікрометодом
Потрібно приготувати:
- мікротитрувальні планшети культуральні 96-ти лункові з пласким дном та кришками;
- стерильні нетоксичні клеючі стрічки для планшетів (якщо використовують термостат без подачі CO2);
- стерильні пробірки місткістю 5 мл для розведень;
- одноразові пластикові піпетки на 1 і 2 мл;
- стерильні одноразові крапельниці на 50 мкл або мікродозатори з наконечниками, що не утворюють аерозоль (з фільтрами);
- флакон з культурою клітин RD;
- суміші сироваток, імунних до ентеровірусів, у робочому розведенні;
- підтримуюче середовище.
Кожен вірус досліджують із сумішшю трьох типів антиполіосироваток, сумішшю антисироваток до вірусів Коксаки (B1-B6) і з сумішами антисироваток до вірусів ECHO.
Віруси, які не типувалися набором імунних сироваток, можливо присутні в досліджуваному матеріалі у вигляді агрегатів і повної їх нейтралізації не відбувається. Для цього слід повторити типування після обробки матеріалу хлороформом (приблизно 10% від об'єму проби). Заморожування культуральної рідини може привести до агрегації вірусів, тому типування проводять після обробки матеріалу хлороформом, але до його заморожування.
Проводять наступну роботу:
- маркірують краї мікротитрувального планшету, як показано на рис. 8.7.;
Рис. 8.7. Ідентифікація виділених штамів ентеровірусів
- вносять по 50 мкл сумішей імунних сироваток у відповідні лунки колонок 1-9;
- вносять по 50 мкл середовища до лунок контролю вірусу (колонка 10, ряди A до D);
- вносять по 100 мкл середовища до лунок контролю клітин (колонки 11 і 12, ряди від A до D);
- готують розведення 10-2 кожного з досліджуваних вірусів (може знадобитися титрування вірусу і підбір відповідного розведення);
- вносять по 50 мкл розведення вірусу N 1 в лунки колонок 1-10 рядів А і В і вірусу N 2 - в лунки колонок 1-10 рядів C і D;
- готують розведення вірусів N 1 і N 2 для титрування і розливають по 50 мкл у відповідні лунки (ряди E і F для вірусу N 1, ряди G і Н - для вірусу N 2);
- закривають планшет і витримують 1 годину при 36 град. С;
- під час контакту трипсинізують клітини RD і готують їх суспензію з концентрацією 1,5 х 105 клітин в 1 мл із розрахунку 10 мл суспензії на один планшет;
- розливають по 100 мкл суспензії в усі лунки;
- закривають планшет нетоксичною клеючою плівкою (стрічкою) і поміщають в термостат при 36 град. С;
- щодня мікроскопують лунки, спостерігають і реєструють розвиток ЦПД;
- після одержання 100% ЦПД в лунках контролю вірусу реєструють результати ще через 24 години;
- ідентифікують вірус за результатами нейтралізації ЦПД відповідними сумішами сироваток, використовуючи таблицю ідентифікації, прикладену до набору сумішей.
7.3.2. Виявлення РНК ентеровірусів в пробах води методом полімеразної ланцюгової реакції зворотної транскрипції
Матеріал для дослідження: неконцентровані проби води та концентрат вірусів.
Елюат в кількості 0,5-1 мл після рекомендованої концентраціїї переносять в пробірки типу "еппендорф", що вільні від РНКаз та ДНКаз.
Перед дослідженням проби зберігають при температурі +2-8 град. С не більше одної доби, тривалий час - при температурі мінус 70 град. С. Допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу.
Доставка проб здійснюється в спеціальному термоконтейнері з охолоджуючими елементами.
Проведення аналізув
Етап 1. Виділення РНК (проводиться в Зоні 1 - кімнаті для обробки матеріалу).
Порядок роботи
1. Лізующий розчин і розчин для відмивання 1 (якщо вони зберігалися при 2-8 град. С) прогріти при 60-65 град. С до повного розчинення кристалів.
2. Відібрати необхідну кількість одноразових пробірок на 1,5 мл з кришкою, що щільно закривається (включаючи негативний і позитивний контролі виділення). Внести в кожну пробірку 5 мкл внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ Enterovirus-rec). Потім по 450 мкл лізуючого розчину. Промаркірувати пробірки.
3. До пробірки з лізуючим розчином і ВКЗ внести по 100 мкл проб, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром. У пробірку з негативним контролем (НК) виділення внести 100 мкл негативного контрольного зразка (НКЗ). У пробірку з позитивним контролем (ПК) виділення внести 90 мкл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка (ПКЗ Enterovirus-rec).
4. Щільно закрити проби, ретельно перемішати за допомогою вортекса і ценрифугувати протягом 5 с при 5 000 об./хв. на мікроцентрифузі для видалення крапель з внутрішньої поверхні кришки пробірки.
5. Ретельно ресуспендувати сорбент за допомогою вортекса. До кожної пробірки окремим наконечником додати по 25 мкл ресуспендованого сорбенту. Перемішати на вортексі, поставити в штатив на 1 хв., ще раз перемішати і залишити на 5 хв.
6. Центрифугувати пробірки для осадження сорбенту при 10 000 об./хв. протягом 30 с на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
7. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
8. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 2. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі, ценрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
9. Повторити відмивання розчином для відмивання 2, дотримуючись п. 8.
10. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 3. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Повністю видалити супернатант з кожної пробірки окремими наконечниками, використовуючи вакуумний аспіратор.
11. Помістити пробірки в термостат 60 град. С на 5-10 хв. для підсушування сорбенту. При цьому кришки пробірок повинні бути відкритими.
12. В пробірки додати по 50 мкл РНК-елюента, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром, вільні від РНКаз. Перемішати на вортексі. Помістити в термостат 60 град. С на 2-3 хв. Перемішати на вортексі і процентрифугувати пробірки на максимальних оборотах мікроцентрифуги (12-13 000 об./хв.) протягом 1 хв.
Супернатант містить очищені РНК. Проби готові до постановки реакції зворотної транскрипції і ПЛР.
Реакцію зворотної транскрипції слід проводити відразу після отримання РНК-проби. Відбирати розчин РНК/ДНК для реакції потрібно дуже обережно, не захоплюючи сорбент. Якщо сорбент скаламутився, необхідно відцентрифугувати.
Етап 2. Постановка реакції зворотної транскрипції і проведення ПЛР (проводиться в Зоні 2 - кімнаті для розкапування реагентів і проведення ампліфікації)
Постановка реакції зворотної транскрипції (загальний об'єм реакції - 20 мкл, об'єм РНК-проби - 10 мкл)
Порядок роботи
При роботі з РНК необхідно використовувати тільки одноразові стерильні пластикові витратні матеріали, що мають спеціальне маркування "RNase-free", "DNase-free".
1. Відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,2 мл.
2. Приготувати реакційну суміш на 12 реакцій. Для цього в пробірку з ліофілізованим DTT додати 125 мкл RT-mix і ретельно перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.
3. До отриманого розчину додати 6 мкл ревертази, перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.
4. Внести в мікропробірки по 10 мкл готової реакційної суміші.
5. Використовуючи наконечники з бар'єром, додати 10 мкл РНК-проби в пробірку з реакційною сумішшю. Обережно перемішати.
6. Поставити пробірки в ампліфікатор (термостат) на 37 град. С на 30 хв.
7. Отриману в реакції зворотної транскрипції кДНК для подальшої постановки ПЛР розвести в 2 рази ДНК-буфером (до 20 мкл кДНК окремим наконечником додати 20 мкл ДНК-буфера).
Готовий препарат кДНК можна зберігати при температурі мінус 20 град. С впродовж 1 тижня або при температурі мінус 70 град. С протягом року.
Постановка ПЛР (загальний об'єм реакції - 25 мкл, об'єм кДНК-проби - 10 мкл)
У всіх комплектах для ампліфікації сімейства АмпліСенс обов'язково застосовується "гарячий старт". Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при 95 град. С.
Підготовка пробірок для проведення ПЛР.
1. Відібрати необхідну кількість пробірок з ПЛР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб.
2. На поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЛР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЛР-сумішшю-1.
3. Зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл, для ампліфікації з кришкою без підігріву).
Порядок роботи
1. Узяти підготовлені для ПЛР пробірки. Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл кДНК, отриманих в реакції зворотної транскрипції РНК.
Позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ПКЗ кДНК.
Негативний контроль ПЛР (К-) - внести в пробірку 10 мкл ДНК-буфера.
2. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (дивися інструкцію до набору).
3. Після закінчення реакції пробірки відправити до кімнати для аналізу продуктів ПЛР (електрофорезу, Зону 3).
Етап 3. Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР-ампліфікації
Робота з ампліфікованими днк повинна проводитися в окремій кімнаті співробітником лабораторії, що не проводить маніпуляцій в Зоні 1 і Зоні 2.
Порядок роботи
1. Пробірки з продуктами ампліфікації виставити в штатив послідовно, відібрати з-під шару масла по 10-15 мкл проб і внести в лунки гелю. В кожному ряді доріжок гелю повинен бути обов'язково представлений К+, К-.
2. Підключити камеру до джерела струму, дотримуючи полярність (ДНК рухається до позитивного електроду), і включити джерело (напруга 250-300 В, стабілізація по напрузі), час електрофорезу - 18-20 хвилин. Оптимальна напруженість електричного поля при цьому складає 10 В/см.
3. Після закінчення електрофорезу, вимкнути джерело струму, перенести гель на трансілюмінатор. Отримати зображення гелю на комп'ютері за допомогою відеосистеми, відзначивши порядок нанесення, занести в базу даних.
Облік результатів
Облік результатів ПЛР-аналізу проводиться за наявності або відсутності на електрофореграмі специфічних смуг ампліфікованої кДНК.
Довжина специфічних смуг ампліфікованих фрагментів кДНК:
- ентеровірусу - 207 п.н.
- ВКЗ Enterovirus-rec - 440 п.н.
1. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу виділення (ПК), повинні бути дві яскраві оранжеві смуги, що світяться: специфічна - на рівні 207 п.н. і смуга внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ) - на рівні 440 п.н.
2. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу виділення (НК), повинна бути тільки смуга ВКО на рівні 440 п.н.
3. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу ПЛР (К+), повинна бути яскрава специфічна оранжева смуга на рівні 207 п.н., що світиться.
4. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу ПЛР (К-) не повинне бути ніяких смуг.
5. Позитивними вважаються зразки, які містять специфічну смугу, що світиться, на рівні 207 п.н. більшої або меншої інтенсивності, незалежно від наявності смуги внутрішнього контролю. Смуга внутрішнього контрольного зразка може бути відсутній в пробах з високою концентрацією РНК Enterovirus.
6. Негативними вважаються зразки, які містять тільки смугу 440 п.н. більшої або меншої інтенсивності
7. Окрім смуг 207 п.н. і 440 п.н. в доріжках можуть спостерігатися нечіткі розмиті смуги праймер-димерів, які розташовуються нижче за рівень 100 нуклеотидних пар.
Результати аналізу не підлягають обліку в наступних випадках:
1. Якщо результати аналізу контрольних зразків не співпадають з приведеними в табл. 8.5., то відповідний етап аналізу слід переробити.
Таблиця 8.5.
Оцінка результатів аналізу контрольних зразків
------------------------------------------------------------------
| Контрольний | Контрольований | Специфічні смуги на |
| зразок | етап | електрофореграмі |
| | ПЛР-аналізу |--------------------------------|
| | |Смуга 207 п.н. |Смуга 440 п.н. |
|-------------+-----------------+---------------+----------------|
|"ПК" |Виділення РНК | Є | Є |
|-------------+-----------------+---------------+----------------|
|"НК" |Виділення РНК | Ні | Є |
|-------------+-----------------+---------------+----------------|
|"К-" |ПЛР | Ні | Ні |
|-------------+-----------------+---------------+----------------|
|"К+" |ПЛР | Є | Ні |
------------------------------------------------------------------
Рис. 8.8. Електрофоретична рухливість продуктів ампфлікації у позитивних контролях
З Рисунками 8.7 - 8.8 можна ознайомитись: розділ "Довідники", підрозділ "Додатки до документів", папка "Накази".
2. Якщо в доріжці якій-небудь з проб відсутні обидві смуги, і 207 п.н. і 440 п.н., результат аналізу по даній пробі вважається недійсним, необхідно повторити дослідження цієї клінічної проби із самого початку. Причиною могла з'явитися помилка в процедурі обробки клінічного матеріалу, що привела до втрати РНК/ДНК або інгібування ЗТ та/або ПЛР.
3. В доріжках з'являються неспецифічні смуги на різних рівнях. Можливі причини: відсутність "гарячого старту" або невірний температурний режим в осередках ампліфікатора.
4. Поява специфічної смуги 207 п.н. в будь-якому з негативних контрольних зразків (НК, К-) указує на контамінацію реактивів або проб. В цьому випадку результати аналізу вважають недійсними. Вимагається повторити аналіз проб, а також вжити заходам по виявленню джерела контамінації.
7.4. Дослідження проб на наявність віруса гепатиту А
7.4.1. Визначення вірусних антигенів ВГА в ІФА
Елюати, отримані після концентрування досліджуваних об'ємів води, аналізуються методом ІФА у відповідності до Інструкціїї, що додається до стандартного комерційного діагностичного набору, зареєстрованого в Україні.
7.4.2. Полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією
Для проведення дослідження рекомендовано використовувати сертифіковані тест-системи.
Для проведення аналізу використовуються проби води без додаткової концентрації або концентрат (елюат). Зразок у кількості 0,5-1 мл переносять в пробірки типу "еппендорф", що вільні від РНКаз та ДНКаз.
Проби зберігають при 2-8 град. С не більше одної доби, тривало - при мінус 70 град. С. Допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу.
Доставка проб здійснюється в спеціальному термоконтейнері з охолоджуючими елементами.
Проведення аналізу
ПЛР-аналіз складається з чотирьох етапів, кожний з яких має свої контрольні зразки:
- виділення РНК;
- отримання комплементарной ДНК (кДНК) на матриці РНК - реакція зворотної транскрипції (ЗТ);
- ампліфікація ділянки ДНК - полимеразная ланцюгова реакція (ПЛР);
- електрофоретический аналіз продуктів ПЛР і облік результатів ПЛР-аналізу.
Етап 1. Виділення РНК (проводиться в Зоні 1 - кімнаті для обробки матеріалу)
Порядок роботи
1. Лізуючий розчин і розчин для відмивання 1 (якщо вони зберігалися при 2-8 град. С) прогріти при 60-65 град. С до повного розчинення кристалів.
2. Відібрати необхідну кількість одноразових пробірок на 1,5 мл з кришкою, що щільно закривається (включаючи негативний і позитивний контролі виділення). Внести в кожну пробірку 5 мкл внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ HAV-rec). Потім по 450 мкл лізуючого розчину. Маркірувати пробірки.
3. В пробірки з лізуючим розчином та ВКЗ внести по 100 мкл проб, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром. В пробірку негативного контролю (НК) виділення внести 100 мкл негативного контрольного зразка (НКЗ). В пробірку позитивного контролю (ПК) виділення внести 90 мкл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка (ПКЗ HAV-rec).
4. Щільно закриті проби, ретельно перемішати на вортексі і ценрифугувати впродовж 5 с при 5 000 об./хв. на мікроцентрифузі для видалення крапель з внутрішньої поверхні кришки пробірки.
5. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. В кожну пробірку окремим наконечником додати по 25 мкл ресуспендованого сорбенту. Перемішати на вортексі, поставити в штатив на 1 хв., ще раз перемішати і залишити на 5 хв.
6. Центрифугувати пробірки для осадження сорбенту при 10 000 об./хв. протягом 30 с на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
7. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
8. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 2. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. Ценрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
9. Повторити відмивання розчином для відмивання 2, згідно з пунктом 8.
10. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 3. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Повністю видалити супернатант з кожної пробірки окремими наконечниками, використовуючи вакуумний аспіратор.
11. Помістити пробірки в термостат 60 град. С на 5-10 хв. для підсушування сорбента. При цьому кришки пробірок повинні бути відкритими.
12. В пробірки додати по 50 мкл РНК-елюента, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром, вільні від РНКаз. Перемішати на вортексі. Помістити в термостат 60 град. С на 2-3 хв. Перемішати на вортексі і центрифугувати пробірки на максимальних оборотах мікроцентрифуги (12 000-13 000 об./хв.) протягом 1 хв.
Супернатант містить очищені РНК. Проби готові до постановки реакції зворотної транскрипції і ПЛР.
Реакцію зворотної транскрипції слід проводити відразу після отримання РНК-проби. Відбирати розчин РНК/ДНК для реакції потрібно дуже обережно, не захоплюючи сорбент. Якщо сорбент скаламутився, необхідно осадити його на центрифузі.
Етап 2. Постановка реакції зворотної транскрипції і проведення ПЛР (проводиться в Зоні 2 - кімнаті для розкапування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації).
Постановка реакції зворотної транскрипції (загальний об'єм реакції - 20 мкл, об'єм РНК-проби - 10 мкл)
Порядок роботи
При роботі з РНК необхідно використовувати тільки одноразові стерильні пластикові витратні матеріали, що мають спеціальну маркіровку "RNase-free", "DNase-free".
1. Відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,2 мл.
2. Приготувати реакційну суміш на 12 реакцій. Для цього в пробірку з ліофілізованим DTT додати 125 мкл RT-mix і ретельно перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.
3. До отриманого розчину додати 6 мкл ревертази, перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.
4. Внести в мікропробірки по 10 мкл готовій реакційній суміші.
5. Використовуючи наконечники з бар'єром, додати 10 мкл РНК-проби в пробірку з реакційною сумішшю. Обережно перемішати.
6. Поставити пробірки в ампліфікатор (термостат) на 37 град. С на 30 хв.
7. Отриману в реакції зворотної транскрипції кДНК для подальшої постановки ПЛР розвести в 2 рази ДНК-буфером (до 20 мкл кДНК окремим наконечником додати 20 мкл ДНК-буфера).
Готовий препарат кДНК можна зберігати при температурі мінус 20 град. С протягом тижня або при температурі мінус 70 град. С протягом року.
Постановка ПЛР (загальний об'єм реакції - 25 мкл, об'єм кДНК-проби - 10 мкл)
У всіх комплектах для ампліфікації сімейства АмпліСенс обов'язково застосовується "гарячий старт". Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при 95 град. С.
Підготовка пробірок для проведення ПЛР
1. Відібрати необхідну кількість пробірок з ПЛР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб.
2. На поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЛР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЛР-сумішшю-1.
3. Зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл).
Порядок роботи
1. Узяти підготовлені для ПЛР пробірки. Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл кДНК, отриманих в реакції зворотної транскрипції РНК.
Позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ПКЗ кДНК.
Негативний контроль ПЛР (К-) - внести в пробірку 10 мкл ДНК-буфера.
2. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (дивися інструкцію до набору).
3. Після закінчення реакції пробірки відправити до кімнати для аналізу продуктів ПЛР (Зону 3). Проби після ампліфікації можна берегти 16 годин при кімнатній температурі, протягом тижня при 2-8 град. С.
Етап 3. Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР-ампліфікації (проводиться в зоні 3 - кімнаті для аналізу продуктів ампліфікації)
Робота з ампліфікованими ДНК повинна проводитися в нкремій кімнаті співробітником лабораторії, що не проводить маніпуляцій в Зоні 1 і Зоні 2.
Порядок роботи
1. Пробірки з продуктами ампліфікації виставити в штатив послідовно, відібрати з-під шару масла по 10-15 мкл проб і внести в лунки гелю. В кожному ряді доріжок гелю повинен бути обов'язково представлений К+.
2. Підключити камеру до джерела струму, дотримуючи полярність (ДНК рухається до позитивного електроду), і включити джерело (напруга 250-300 В, стабілізація по напрузі), час електрофорезу - 18-20 хв. Оптимальна напруженість електричного поля при цьому складає 10 В/см.
3. Після закінчення електрофорезу, вимкнути джерело струму, перенести гель на трансілюмінатор. Отримати зображення гелю на комп'ютері за допомогою відеосистеми, відзначивши порядок нанесення, занести в базу даних.
При дослідженні гелю і фотографуванні очі повинні бути захищений спеціальною маскою або скляною пластиною!
Облік результатів
Облік результатів ПЛР-аналізу проводиться по наявності або відсутності на електрофореграмі специфічних смуг ампліфікованої кДНК.
Довжина специфічних смуг ампліфікованих фрагментів кДНК:
- вірусу гепатиту А (HAV) - 430 п.н.
- внутрішнього контролю (ВКЗ) - 680 п.н.
1. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу виділення (ПК), повинні бути дві яскраві оранжеві смуги, що світяться: специфічна - на рівні 430 п.н. і смуга внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ) - на рівні 680 п.н. (табл. 8.6.)
Таблиця 8.6.
Оцінка результатів аналізу контрольних зразків
------------------------------------------------------------------
| Контрольний | Контрольований | Специфічні смуги на |
| зразок | етап ПЛР-аналізу | електрофореграмі |
| | |------------------------------|
| | |Смуга 430 п.н. |Смуга 680 п.н.|
|--------------+------------------+---------------+--------------|
|"ПК" |Виділення РНК | Є | Є |
|--------------+------------------+---------------+--------------|
|"НК" |Виділення РНК | Ні | Є |
|--------------+------------------+---------------+--------------|
|"К-" |ПЛР | Ні | Ні |
|--------------+------------------+---------------+--------------|
|"К+" |ПЛР | Є | Ні |
------------------------------------------------------------------
2. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу виділення (НК), повинна бути тільки смуга ВКЗ на рівні 680 п.н.
3. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу ПЛР (К+), повинна бути яскрава специфічна оранжева смуга на рівні 430 п.н., що світиться.
4. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу ПЛР (К-) не повинне бути ніяких смуг.
5. Позитивними вважаються зразки, які містять специфічну смугу, що світиться, на рівні 430 п.н. більшої або меншої інтенсивності, незалежно від наявності смуги внутрішнього контролю. Смуга внутрішнього контрольного зразка може бути відсутній в пробах з високою концентрацією РНК.
6. Негативними вважаються зразки, які містять тільки смугу 680 п.н. більшої або меншої інтенсивності
7. Окрім смуг 430 п.н. і 680 п.н. в доріжках можуть спостерігатися нечіткі розмиті смуги праймер-димерів, які розташовуються нижче за рівень 100 нуклеотидних пар.
Результати аналізу не підлягають обліку в наступних випадках:
1. Якщо результати аналізу контрольних зразків не співпадають з наприведеними в табл. 8.6., то відповідний етап аналізу слід переробити.
2. Якщо в доріжці якій-небудь з проб відсутні обидві смуги, і 430 п.н. і 680 п.н., результат аналізу по даній пробі вважається недійсним, необхідно повторити дослідження цієї клінічної проби із самого початку. Причиною могла з'явитися помилка в процедурі обробки клінічного матеріалу, що привела до втрати РНК/ДНК або інгібування ЗТ та/або ПЛР.
3. У доріжках з'являються неспецифічні смуги на різних рівнях. Можливі причини: відсутність "гарячого старту" або невірний температурний режим в осередках ампліфікатора.
4. Поява специфічної смуги 430 п.н. в будь-якому з негативних контрольних зразків (НК, К-) указує на контамінацію реактивів або проб. В цьому випадку результати аналізу вважають недійсними. Вимагається повторити аналіз проб, а також вжити заходи по виявленню джерела контамінації.
8. Методи дослідження проб на наявність кишкових фагів
З багаточисельної групи фагів як санітарно-показові віруси визначені постійно наявні у кишечнику людини соматичні коліфаги, які у великій кількості потрапляють у стічні води, у водойми зі стічними водами та поверхневим стоком і, як слідство, у питну воду (водопровідну, колодязну та інші джерела).
Коліфаги - це бактеріальні віруси, котрі складаються з капсиду, який вміщує одно- або двуниткову ДНК в якості геному.
Виявлення у воді кишкових бактеріофагів може свідчити про наявність патогенних вірусів, особливо у питній воді. Наявність їх у воді з резервуару чистої води станції водопідготовки вказує на недосконалість технології водопідготовки, а у воді з мережі водопостачання, крім вказаного, - про наявність умов вторинного забруднення, зокрема збудниками вірусних інфекцій.
Коліфаги слугують найбільш адекватною моделлю оцінки ефективності того чи іншого прийому очистки та знезараження води від вірусів. Методи їх визначення доступні лабораторіям любого рівня, не потребують спеціального обладнання та дають можливість отримати результати вже через 6-24 годин.
Бактеріофаги здатні інфікувати певні штами хазяїна E.coli та утворювати видимі бляшки (зони лізису, прозорі зони) різного розміру та морфології на зливному газоні бактеріального росту хазяїна за відповідних умов культивування. Визначення коліфагів можна проводити двома методами:
- титраційним методом (метод накопичення) або найбільш вірогідного числа (НВЧ);
- прямим методом без попередньої концентрації коліфагів та після їх концентрації.
Титраційний метод дозволяє виявляти незначну кількість коліфагів в об'єкті, але загальний об'єм води, як правило, не перевищує 1 л. Цей метод застосовується при дослідженні питної води після очистки та знезараження, води з розподільчої системи або інших малозабруднених об'єктів. Отримання результату можливе через 24-48 годин.
Прямий метод застосовується для визначення коліфагів у стічній воді та інших водних об'єктах зі значним антропогенним забрудненням. Застосування прямого методу визначення коліфагів у питній воді має технічну обмеженість внаслідок неможливості дослідження великих об'ємів. В той же час він застосовується для визначення коліфагів у питній воді та інших видах чистих вод після попередньої концентрації фагів з великих об'ємів у малі. Використовують методи концентрації хлоридом алюмінія та ГГМКК. Результат отримують через 6-24 годин.
8.1. Відбір проб для дослідження
Відбір проб різних видів вод для дослідження на наявність коліфагів відрізняється від вказаного в Розділі 4 цих методичних рекомендацій об'ємом проб. Стічну воду відбирають об'ємом 100 мл. Воду з інших об'єктів відбирають об'ємом 1000 мл, якщо не передбачена концентрація. При необхідності концентрації коліфагів пробу відбирають об'ємом 10 л.
Необхідність концентрації коліфагів доречно проводити у пробах води за епідпоказниками, коли дослідження води на патогенні віруси негативні, а коліфаги в 1000 мл не визначаються, у той час, як реєструється захворюваність населення на вірусні інфекції з водним шляхом передачі.
Концентрація коліфагів також доречна при дослідженні різних видів питної води з метою надати у короткий строк більш достовірну оцінку можливості проходження вірусів через ті чи інші етапи очисних споруд та можливої наявності вірусів в інших видах вод (колодязній, зі скважини, каптажів, інших індивідуальних джерел питної води).
Незадовільна якість води за санітарно-хімічними та бактеріологічними показниками також може спонукати до визначення коліфагів з їх попередньою концентрацією, що суттєво доповнить характеристику води та роботу очисних споруд стосовно антивірусного бар'єру.
8.2. Дослідження проб стічної води
Кількість коліфагів у стічній воді, як правило, знаходиться на рівні сотень та сотень тисяч в одному мл в залежності від характеру стічних вод та ступеня їх очистки. Допустимий рівень коліфагів в очищеній стічній воді, яку дозволено скидати у водоймище, повинен дорівнювати 1000 бляшкотвірних одиниць в літрі (БТО/л) (СанПиН 4630-88 "Охрана поверхностных вод от загрязнения", Москва, 1988). Стічну воду досліджують двошаровим методом посіву за Граціа. Метод складається з наступних складових:
- приготування тест-культури хазяїна E.coli В або E.coli С;
- приготування чашок Петрі з 2% м'ясо-пептонним агаром (МПА) для нижнього шару;
- приготування суміші відповідних об'ємів досліджуваної проби, культури хазяїна E.coli та 1,0% МПА для верхнього шару агара;
- контроль можливої контамінації фагом середовищ і матеріалів, які використовуються (негативний контроль);
- контроль чутливості тест-культури хазяїна до соматичних коліфагів (позитивний контроль).
Приготування тест-культури хазяїна, постановку негативного та позитивного контролів виконують відповідно до пунктів 11.1.1.; 11.1.4.; 11.1.5 Методичних вказівок MB 10.2.1-113-2005 "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води", Київ, 2005.
8.2.1. Проведення аналізу
Розтоплюють 2,0% МПА і розливають у чашки Петрі по 15-20 мл в кожну. Флакон зі 100 кв.см 1,0% МПА розтоплюють і доводять до 48 град. С на водяній бані. Використовують десятикратні розбавлення проби стічної води від 102 до 1012. Всі дози посівів досліджують у двох повторностях. Вихідну воду досліджують по 1 мл
2 4 з розбавлень (наприклад, 10 та 10 ). Воду після повного циклу очистки та знезараження досліджують в об'ємі 1 мл вихідної води та
2 з розбавлення 10 . Приготовлені розбавлення по 1 мл розливають у два ряди пробірок, додають 0,5 мл "нічної" бульйонної культури хазяїна, 5 мл розтопленого 1,0% МПА та виливають на приготовлений заздалегідь шар 2,0% МПА у чашках Петрі. Виливають приготовлену суміш (верхній шар) на нижній шар агару і швидко розподіляють по поверхні агару, дають можливість застигнути та інкубують у термостаті при 36 +- 1 град. С протягом 6 годин, після чого виймають і підраховують кількість бляшок лізису культури хазяїна, тобто БТО на чашці. Після підрахунку БТО чашки з посівами залишають до слідуючого дня при кімнатній температурі і роблять остаточний підрахунок БТО та їх розрахунок на одиницю об'єму (на мл чи на л в залежності від точки відбору проб). В разі неможливості інкубації при двух температурах надають перевагу інкубації при 36 +- 1 град. С. Результат вважається прийнятним при одержанні відповідних позитивного та негативного контролів.
8.3. Дослідження проб води
поверхневих водоймищ
Воду поверхневих водоймищ досліджують об'ємом 10-100 мл в залежності від ступеня їх забруднення. Нижня границя досліджуваного об'єму (10 мл) обумовлена нормативом допустимого рівня коліфагів води поверхневих водоймищ, який дорівнює 100 БТО в одному літрі води. При цьому використовують прямий метод посіву, описаний в п. 9.21 цих методичних рекомендацій з деякими змінами, викладеними нижче. Від загального об'єму проби води відбирають 10 мл і розподіляють цей об'єм по 2,0 мл у 5 пробірок, куди додають 0,5 мл бульйонної культури хазяїна E.coli В, та 5 мл 2,0% МПА. Виливають отриману суміш на нижній шар 2,0% МПА, розлитого в чашки Петрі. Інкубацію проводять як описано в п. 9.2.1. Підраховують загальну кількість БТО на чашках сумарно та розраховують їх кількість в 1 л води.
8.4. Дослідження проб питної води
Питна вода з різних джерел водопостачання досліджується об'ємом 1 л. У відповідності з діючою нормативною документацією коліфаги у питній воді повинні бути відсутніми в об'ємі 1 л (ДСанПіН "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання, Київ, 1999). Для дослідження використовується титраційний метод (метод накопичення, або НВЧ) у відповідності з розділом 11.1 Методичних вказівок MB 10.2.1-113-2005 "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води", Київ, 2005.
В разі необхідності концентрації коліфагів досліджують пробу об'ємом 10 л. Застосовують метод осадження хлоридом алюмінія або сорбції ГГМКК.
Осадження хлоридом алюмінія. У пробу води, підігріту до 18-20 град. С, додають 10% розчин хлориду алюмінія з розрахунку 2 мл на 1 л проби. Доводять рН до 5,8-6,0, обережно перемішують пробу до утворення пластівців. Залишають пробу на 16-18 годин при 4 град. С до утворення осаду (при неможливості залишають пробу при кімнатній температурі). Надосадову рідину зливають, а пухкий осад переносять у чотири 250 мл флакони та центрифугують при 2000 об./хв., протягом 15 хв. Надосадову рідину зливають. У кожний флакон додають елюент - по 5,0 мл м'ясо-пептонного бульйону (МПБ) подвійної концентрації з 10% Na HPO (рН 9,2). Флакони з елюентом
2 4 інтенсивно струшують 10 хв. Після цього осад з елюентом переносять в один флакон і знов центрифугують при вказаному режимі, надосадову рідину збирають в окремий флакон і досліджують прямим методом посіву як вказано вище у пункті 5.3. Отриманий об'єм елюенту розподіляють по 2,0 мл у відповідну кількість пробірок, до них додається все необхідне у відповідності до пункту 8.3.
Заступник директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Л.М.Мухарська
Список
використаних джерел
1. Основи законодавства України про охорону здоров'я ( 2801-12 ).
2. "Положення про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в Україні", затв. Постановою Кабінету Міністрів України 22.06.99 N 1109, в редакції Постанови Кабінету Міністрів України від 19.08.02. N 1217.
3. Закон України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення" ( 4004-12 ).
4. Закон України "Про захист населення від інфекційних хвороб" ( 1645-14 ).
5. ДСП N 9.9.5.064.2000 "Порядок видачі дозволів на роботу із мікроорганізмами 1-4 груп патогенності та рекомбінантними молекулами ДНК".
6. Постанова від 27.05.1998 р. N 11 "Про порядок розробки, викладення, оформлення, затвердження державних санітарних правил і норм, гігієнічних нормативів та методичних документів".
7. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. ВОЗ-2003.
8. "Правила функціонального устрою та експлуатації приміщень лабораторії молекулярно-генетичних досліджень".
9. "Методичні рекомендації по проведенню робіт в діагностичних лабораторіях, які використовують метод полімеразної ланцюгової реакції", Київ, 1995.
10. Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я N 219-2005. Концентрація ротавірусів із стічних вод за допомогою поліметилсилоксанового адсорбенту "Ентеросгель". Автори: Дзюблик І.В., Обертинська О.В., Миколенко Н.І., Київ, 2005.
11. Методичні вказівки МВ 10.2.1-113-2005 "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води", Київ, 2005.
12. СанПин 4630-88 "Охрана поверхностных вод от загрязнения", Москва, 1988.
13. ДСанПін "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання", Київ, 1999.
14. Методичні рекомендації "Організація роботи лабораторії при дослідженні біоматеріалу методом полімеразної ланцюгової реакції", Київ, 2007.
15. Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я N 247-2005 "Застосування швидких імунохроматографічних тестів в діагностиці ротавірусної інфекції у дітей в спеціалізованих дитячих лікувальних закладах". Дзюблик І.В., Ковалюк О.В., Обертинська О.В., Костенко О.О., Київ, 2005.
Додаток 1
до Методичних вказівок
Апаратура,
основні матеріали, реактиви, поживні середовища
Для проведення санітарно-вірусологічного дослідження використовують:
- Автоклав великий (або настільний для маленьких лабораторій).
- Бокс біологічної безпеки з запасними фільтрами безпеки II класу (ламінарна шафа).
- Ваги (аналітичні , електронні, торсійні, лабораторні).
- Водяна баня.
- Дистилятор води електричний.
- Дозатори автоматичні (одно- та восьмиканальні).
- Ізотермічні сумки.
- Камера підрахунку клітин.
- Колби скляні з градуйованою горловиною.
- Колби скляні лабораторні.
- Мікроскоп інвертований.
- Морозильна камера (-20 град. С) типу прилавка; морозильна камера (-70 град. С).
- Одноразовий посуд для культивування культур клітин - стерильні культуральні флакони, пробірки, планшети, піпетки тощо.
- Посуд для відбору проб води з об'єктів довкілля.
- Посуд медичний скляний.
- Пробірки скляні.
- Пробки конусоподібні.
- РН-метр з запасними електродами будь-якої марки або фірми-виробника.
- CO -інкубатор.
2
- Стерильні скельця для культури клітин.
- Сухожаровий стерилізатор.
- Термометри стандартні (0-100 град. С).
- Апарат для фільтрації будь-якої марки або фіми-виробника.
- Ультрафільтраційна система "Мінітан".
- Термостати електричні, сухожарові з автоматичним терморегулятором до 50 град. С.
- Утримувач фільтрів розміром 30, 70, 140 мм.
- Холодильник побутовий елетричний з температурою камери 4-6 град. С.
- Центрифуга лабораторна рефрижераторна.
- Центрифуга низькошвидкісна з охолодженням.
- Циліндри вимірювальні ємністю 100, 250, 500 куб.см.
- Чашки Петрі (діаметром 90-100 мм).
- Алюміній сірчанокислий.
- Аеросил-300, Калушського дослідного виробництва IX поверхонь АН України (Івано-Франківська обл.), ГОСТ 14922-77.
- Вата медична гігроскопічна.
- Калій фосфорнокислий двозаміщений.
- Кислота оцтова.
- Трис буфер 0,05 М рН 8,4
- Лейкопластир.
- Марля медична.
- Натрій фосфорнокислий двозаміщений безводний.
- Поліетиленгліколь з М.В. 6000, 4000.
- Гідрогель метилкремнієвої кислоти ГГМКК виробництва КРЕОМА ФАРМ, Київ (вул. Радищева, 3; м. Київ, Україна 03680, тел. (044) 455-35-40/41 тел./факс (044) 497-95-45).
- Розчин версену.
- Розчин трипсину 0,25%.
- Розчин Хенкса, рН 7,0.
- Середовище RPMI -1640, рН 7,3.
- Середовище Ігла ДМЕМ для культури клітин, рН 7,2.
- Середовище Ігла МЕМ для культури клітин, рН 7,2.
- Середовище Ігла, рН 7,2.
- Сироватка великої рогатої худоби без консерванту, виробництва
- Сироватка теляча ембріональна без консерванту.
- Спирт етиловий ректифікований.
- Фільтр типу Петрянова.
- "Набор для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды в системе децентрализованого хозяйственно-питьевого водоснабжения поверхностных и сточных вод", производства ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ Республики Беларусь, г. Минск, тел./факс (375017) 2-26-52-63, ТУ РБ 100558032.047-2001, Регистрационное удостоверение N ИМ-7 1705.
Додаток 2
до пп. 8.1.5, 8.2.3,
8.3.2, 8.4.2
Методичних вказівок
Перелік
устаткування ПЛР-лабораторії
Для обробки матеріалу і виділення НК:
1. Бокс біологічної безпеки II класу.
2. Центрифуга клінічна для пробірок об'ємом 5-100 мл.
3. Центрифуга - вортекс.
4. Мікроцентрифуга від 12 до 16 000 g для мікроцентрифужних пробірок об'ємом 1,5 мл.
5. Твердотільний термостат для пробірок об'ємом 1,5 мл діапазоном робочих температур 25-100 град. С.
6. Набір автоматичних піпеток змінного об'єму (мінімум 3 піпетки: до 20 мкл, до 200 мкл і до 1000 мкл).
7. Одноразові поліпропіленові мікроцентрифужні пробірки з кришками, що загвинчуються або щільно закриваються, об'ємом 1,5 мл.
8. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму до 200 і до 1000 мкл.
9. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму з аерозольним бар'єром до 20, 200 і до 1000 мкл.
10. Штативи для наконечників та мікро пробірок об'ємом 1,5 мл.
11. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
12. Посуд з дезінфікуючим розчином.
Для приготування ПЛР-суміші і проведення ампліфікації:
1. Настільний ПЛР- бокс з бактерицидною лампою.
2. Ампліфікатор (термоциклер).
3. Набір автоматичних піпеток змінного об'єму (мінімум 3 штуки).
4. Одноразові поліпропіленові пробірки для ампліфікації об'ємом 0,5 або 0,2 мл (в залежності від марки ампліфікатора).
5. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму з аерозольним бар'єром до 20 та 100 мкл.
6. Штативи для наконечників та мікро пробірок на 0,5 або 0,2 мл.
7. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
8. Ємкість для скидання відпрацьованих витратних матеріалів.
9. Детектор флюоресценції типу "Джин" (при необхідності).
Для електрофоретичного аналізу продуктів ПЛР:
1. Камера для горозинтального електрофорезу.
2. Джерело постійного струму з напругою 150-460 В.
3. Транс ілюмінатор з кабінетом або камерою для перегляду гелів.
4. Відеосистема з цифровою відеокамерою для реєстрації результатів.
5. Комп'ютер для аналізу результатів електрофорезу.
6. Мікрохвильова піч для плавлення агарози.
7. Колба конічна з термостійкого скла для плавлення агарози об'ємом 250 мкл.
8. Мірні циліндри об'ємом 1 л та 100 мл.
9. Штатив для мікропробірок на 0,5 мл.
10. Окрема автоматична піпетка до 20 мкл.
11. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму до 20 мкл в штативі.
12. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
13. Ємкість для скидання відпрацьованих витратних матеріалів.
Для гібридизаційно-ферментної детекції продуктів ПЛР:
1. Термостат планшетний, що підтримує температуру 37 град. С.
2. Вошер (не обов'язково).
3. Планшетний спектрофотометр.
4. Комп'ютер (повинен бути зв'язаний через комп'ютерну мережу з комп'ютером, розташованим у чистій зоні і призначений для аналізу результатів гібридизації).
5. Вісьмиканальна піпетка до 200 мкл.
6. Окремий набір одно канальних автоматичних піпеток змінного об'єму.
7. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму.
8. Мірний циліндр об'ємом 1 л.
9. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
10. Ємкість для скидання відпрацьованих витратних матеріалів.
Додаток 3
до п. 6.4
Методичних вказівок
Одержання гелю бентоніта
Шматки сухого бентоніту (наприклад, Курцівського родовища) диспергують у п'ятьох об'ємах дистильованої води (вага : об'єм). Для переходу бентоніту в натрієву форму до суспензії додають вуглекислий натрій (вуглекислий натрій ДСТ 4201-66) до 1 М концентрації, витримують 1 день при кімнатній температурі і кип'ятять на невеликому вогні при помішуванні впродовж одної години. Центрифугують 10 хв. при 2000 об./хв., надосадову рідину видаляють, осад суспендують у потрійному об'ємі дистильованої води в гомогенізаторі типу РТ-2. Центрифугують 15 хвилин при 2000 об./хв. Сама нижня частина осаду, що складається із забруднюючих речовин, відділяється. Інший осад тричі відмивають у потрійному об'ємі дистильованої води протягом 10 хвилин при 2000 об./хв. Відмитий бентоніт заливають 20 об'ємами дистильованої води (стосовно вихідної ваги матеріалу) і струшують у шуттель-апараті 2 години, потім суспензію центрифугують 10 хвилин при 1000 об./хв. Осад, що складається з грубих часток бентоніту і забруднюючих речовин, видаляють. Надосадову рідину (мілкодисперсну фракцію) центрифугують протягом 30 хвилин при 2000 об./хв., при цьому бентоніт седиментується. Осад, крім самої нижньої частини, що містить забруднюючі компоненти, суспендують у 0,14 М розчину NaCl (хлористий натрій ДСТ 4233-6) і знову осаджують при 2000-3000 об./хв. протягом 30 хв. Фракціонування повторюють тричі, видаляючи саму нижню частину осаду. Після третього центрифугировання осад, що представляє собою мілкодисперсну фракцію бентоніту, суспендують у бідистильованій воді до одержання 5-6% суспензії гелеподібної консистенції.
Вміст бентоніту в гелі визначають шляхом його висушування в сухожаровій шафі при 105 град. С с наступним зважуванням сухого залишку. Гель стерилізують автоклавуванням при 0,5 атм протягом 40 хвилин. Гель бентоніту зберігає сорбційні властивості по відношенню до ентеровірусів протягом багатьох років збереження при кімнатній температурі.
Додаток 4
до розділів 6, 7
Методичних вказівок
Ультрафільтраційна система мінітан
В основі роботи ультрафільтраційної системи Мінітан лежить принцип тангенціального потоку через ультрафільтраційні чи мікропористі мембрани. Під дією перестальтичного насосу розчин переходить із резервуару, що знаходиться під атмосферним тиском в корпус із системи Мінітан із швидкістю 100-1000 мл/хв. Зконцентрована фракція повертається в резервуар, а фільтрат збирається в окремому приймачі. Для концентрування вірусів, білків і клітин потрібно вихідний об'єм до 2 л в залежності від бажаного ступіня концентрації.
Завдяки особливостям конструкції пакетика, що має вигляд стопки фільтрів із сепараторів, утворюється постійний плавний потік фракції, що затримується. При такому способі фільтрації відбувається відмивання матеріалу з фільтра за допомогою постійного току рідини, направленим взовж його поверхні. Можливе використання 60 кв.см або 6000 кв.см.
Фірма "Sartorius"
Метод концентрування вірусів у пробах води.
1. Концентрація в системі Sartokon-Mini з модулем (межа відсічення 30 кДа) при пробі V = 3000 мл до V = 400 мл. Час концентрувння - 5 хв.
2. Концентрування на ультраячейці SM 16667 при пробі V = 400 мл, концентрація до V = 1 мл за час 10 хв.
3. Регенерація системи - 20 хв.
4. Загальний час концентрація однієї проби, включаючи регенерацію, 35 хв.
Додаток 5
до розділів 6, 8
Методичних вказівок
Метод
оцінки ефективності концентрації вірусів
("Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита
в окружающей среде. ВОЗ-2003")
Оскільки в кожному алгоритмі дослідження проб води представлені кілька методів концентрації вірусів, то перед тим як вибрати той метод, який планується застосовувати в лабораторії з урахуванням її можливостей та досвіду персоналу необхідно провести оцінку його придатності, тобто атестувати метод в лабораторії. Для цього відому кількість вакцинного поліовірусу типу I (штам Себіна) змішують з відібраною пробою стічної води, далі концентрують вірус із проби тим методом, що планується застосовувати, та визначають кількість поліовірусу типу I в концентраті (елюаті).
Порядок проведення дослідження
1. Готують стандартну серію 10-кратних розведень вірусовмісного культурального матеріалу з відомим титром інфекційної активності. Далі розраховують розведення вірусу так, щоб у об'ємі 100 мл та 1 мл містилось по 20 ТЦД вірусу. З метою
50 перевірки визначеного титру та правильності розрахунків проводять стандартне титрування в культурі клітин мікрометодом та визначають титр у вірусовмісному культуральному матеріалі, що був взятий для дослідження, у зразку об'ємом 100 мл та у зразку об'ємом 1 мл.
2. 1 л проби стічної води ділять на 2 рівні частини. До однієї з них (0,5 л) додають 20 ТЦД вірусу та проводять
50 концентрування одночасно в двох частинах проби води за вибраним методом.
3. Після деконтамінації концентрату (елюату) з проби, в яку вносили вірус, відбирають 0,9 мл концентрату і готують наступні розведення на підтримуючому середовищі: 0,7 мл концентрату + 1,4 мл середовища; 0,2 мл концентрату + 1,8 мл середовища. Таким чином, отримують розведення концентрату відповідно 1:3 (2,1 мл) та 1:10 (2,0 мл). Матеріал заморожують та зберігають при мінус 20 град. С.
4. У 5 флаконів на 50 мл з культурою клітин Нер-2 або RD та в 1 флакон на 50 мл з культурою клітин RD(A) на сформовані моношари вносять по 0,5 мл деконтамінованого концентрату (елюату) з проби, в яку вносили вірус.
5. У 2 флакони на 50 мл з культурою клітин Нер-2 або RD та в 1 флакон на 50 мл з культурою клітин RD(A) на сформовані моношари вносять по 0,5 мл деконтамінованого концентрату (елюату) з проби, в яку поліовірус I типу не вносили.
6. Культури клітин поміщають у термостат при 37 град. С та інкубують до формування ЦПД.
7. Якщо хоча б у моношарах 2 флаконів із 6, до яких було внесено концентрат з вірусом, проявляється ЦПД, то метод вважається атестованим. Якщо поліовірус не виявляють, то процедуру тестування проводять повторно, починаючи з п. 2, але вже вносять вірус у дозі 100 ТЦД. У цьому випадку метод вважається атестованим, якщо у всіх 6 флаконах, до яких було внесено концентрат з вірусом, проявляється ЦПД.
Додаток 6
до Методичних вказівок
Нормативні посилання
Основою цих методичних вказівок є такі законодавчі та нормативні документи:
1. Закон України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення" ( 4004-12 ).
2. ДСанПіН "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання" (затверджено наказом Міністерства охорони здоров'я України від 23.12.96 за N 383, зареєстровано Міністерством юстиції України від 15.04.97 за N 136/1940).
3. Методическое руководство по биотестированию воды. РД 118.02.09.- М., 1991.
4. Методические указания по санитарно-микробиологическому контролю поверхностных водоемов. N 2285-81.
5. Методичні рекомендації по проведенню епідеміологічного і санітарно-вірусологічного нагляду за якістю джерел водопостачання, питної води в системі водопостачання з метою профілактики захворювання гепатитом А та іншими кишковими вірусними інфекціями. N 01-19/12-13.- К., 1982.
6. Методичні рекомендації по застосуванню бентоніту для виявлення ентеровірусів у людини і в навколишньому середовищі. - К., 1986.
7. Методические рекомендации по контролю и оценке вирусного загрязнение объектов окружающей среды. N 4146-86.- М., 1986.
8. Методические рекомендации "Ротавирусная инфекция" - М., 1989.
9. Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды. - М., 1982.
10. Методичні рекомендації "Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції в умовах практичної вірусологічної лабораторії". - К., 2003.
11. Руководство по контролю качества питьевой воды/ Рекомендации. - Т.І. - Женева: ВОЗ, 1994.
12. Методичні рекомендації "Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції". - К., 2002.
13. Методичні рекомендації "Епідеміологія і профілактика ротавірусної інфекції". - К., 2003.
14. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. - Женева: ВОЗ, 2003.