МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
НАКАЗ
02.06.2005 N 247
Про затвердження документів
з питань контролю якості препаратів крові
Відповідно до статті 18 Закону України "Про донорство крові та її компонентів" ( 239/95-ВР ) та постанови Кабінету Міністрів України від 15.01.96 N 73 "Про затвердження Положення про контроль за відповідністю імунобіологічних препаратів, що застосовуються в медичній практиці, вимогам державних та міжнародних стандартів" (із змінами), з метою приведення у відповідність до вимог державних та міжнародних стандартів показників якості препаратів крові, що виробляються в Україні наказую:
1. Затвердити та ввести в дію з 01.09.2005 року настанови з якості медичних імунобіологічних препаратів:
1.1. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на плазму людини для фракціонування" (додається);
1.2. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на розчин альбуміну донорського 5, 10 і 20%" (додається);
1.3. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на імуноглобулін людини нормальний, рідкий" (додається);
1.4. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на імуноглобулін людини антирезус Rho (D) рідкий" (додається);
1.5. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на імуноглобулін людини антистафілококовий, рідкий" (додається);
1.6. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на імуноглобулін людини проти краснухи, рідкий" (додається);
1.7. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на імуноглобулін людини проти гепатиту В, рідкий" (додається);
1.8. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на імуноглобулін людини проти вітряної віспи, рідкий" (додається);
2. Встановити, що заклади переливання крові України, які знаходяться у сфері управління Міністерства охорони здоров'я України, керуються затвердженими в пункті 1 документами при складанні аналітично-нормативних документацій на перелічені препарати при їх реєстрації. Іншим суб'єктам господарювання рекомендується керуватись затвердженими в пункті 1 документами при складанні аналітично-нормативних документацій на перелічені препарати при їх реєстрації.
3. Державній службі лікарських засобів і виробів медичного призначення Міністерства охорони здоров'я України у тримісячний термін забезпечити опублікування цього наказу в засобах масової інформації.
4. Контроль за виконанням наказу покласти на заступника Міністра Рибчука В.О.
Міністр М.Є.Поліщук
Затверджено
Наказ Міністерства охорони
здоров'я України
02.06.2005 N 247
Державний Герб України
Медичні імунобіологічні препарати
Настанова з якості
Керівництво по складанню аналітично-нормативної
документації на плазму людини для фракціонування
Настанова 42-3002-001-2005
Київ
Міністерство охорони здоров'я України
2005
Зміст
1. Сфера застосування та основні вимоги
2. Специфікація
2.1. Свіжозаморожена плазма (СЗП)
2.2. Заморожена плазма (ЗП)
3. Методи контролю
3.1. Опис
3.2. Відсутність інфекцій, що переносяться при гемотрансфузіях
3.3. рН
3.4. Вміст білку
3.5. Колірність (гемпігменти)
3.6. Фактор VIII
3.7. Пакування
1. Сфера застосування та основні вимоги
Це керівництво по складанню аналітично-нормативної документації поширюється на - Плазму людини для фракціонування, що являє собою рідку частину донорської крові, яка пройшла контроль на відсутність інфекцій, що переносяться при гемотрансфузіях, відповідно до Інструкцій:
- Медичний огляд донорів крові, плазми, клітин крові;
- Порядок карантинізації донорської плазми;
- Заготівля крові;
- Інструкція по фракціонуванню донорської крові на її компоненти (плазма, еритроцити, тромбоцити, лейкоцити) та їх консервування;
- Інструкція з донорського плазмафереза;
Плазма отримується шляхом відділення від формених елементів крові центрифугуванням або методом плазмафереза в присутності антикоагулянта.
Плазма призначена для виробництва лікарських засобів.
За способом заготівлі плазма поділяється на:
свіжозаморожена плазма (СЗП) - отримана методом плазмафереза або виділена із цільної крові після відділення формених елементів центрифугуванням і заморожена якнайшвидше, але не пізніше 4 годин після взяття крові у донора при температурі, не вище мінус 30 град. С. Призначення - одержання факторів згортання крові (лабільні білки плазми).
заморожена плазма (ЗП) - виділена із цільної крові і заморожена при температурі, не вище мінус 30 град. С якомога скоріше, але не пізніше 24 годин після взяття крові у донора. Призначення - для одержання стабільних білків плазми (імуноглобуліни, альбуміни тощо).
Будь-яка плазма, яка містить титри специфічних антитіл, може використовуватись для виробництва специфічних імуноглобулінів. Кількісне визначення специфічних антитіл (титр, МО, УО) встановлюється нормативними та нормативно-технічними документами на специфічні імуноглобуліни та проводиться акредитованими лабораторіями. Така плазма повинна бути додатково промаркована як "специфічна", з вказанням титру специфічних антитіл.
Кожна поставка всіх видів замороженої плазми в гемоконах повинна супроводжуватись двома сегментами довжиною, не менше 7 см. Поставка плазми супроводжується документацією:
1. Списки донорів з чіткою ідентифікацією кожної донорської порції, включеної в відповідну поставку.
2. Сертифікатом на всю поставку, який повинний містити наступну інформацію:
Індивідуальний номер донора;
тип і кількість коагулянта;
група крові, резус;
дата заготівлі крові;
температурний режим зберігання та транспортування;
терміни карантинізації;
установа, що здійснила взяття крові;
вид плазми (специфічна/неспецифічна);
об'єм плазми в мл;
результати тестів на наявність збудників інфекцій, які переносяться при гемотрансфузіях, включаючи критерії придатності, та які тест-системи і види тестів використовувались.
2. Специфікація
2.1. Свіжозаморожена плазма (СЗП)
Специфікація
------------------------------------------------------------------
| Найменування | Встановлені значення | Метод контролю |
|показників контролю| | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
| 1 | 2 | 3 |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Опис. |В замороженому стані - |За п. 3.1, |
| |щільна затверділа маса |візуально для |
| |жовтуватого або з |кожної порції |
| |зеленуватим відтінком |плазми. |
| |кольору. | |
| | | |
| |В рідкому стані - | |
| |прозора або злегка | |
| |мутна рідина без явних | |
| |ознак гемолізу від | |
| |світло жовтого до | |
| |кольору з зеленуватим | |
| |відтінком. | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Відсутність |Антитіла до ВІЛ 1 та 2 -|За п. 3.2. для |
|інфекцій, що |не виявляються. |кожної порції |
|переносяться при |Антитіла до гепатиту С -|плазми результати |
|гемотрансфузіях. |не виявляються. |обстеження донорів |
| |Поверхневий антиген |на СПК. |
| |вірусу гепатиту В | |
| |(HBsAg) та cor-антитіла | |
| |до вірусу гепатиту В не | |
| |виявляються. | |
| |Антитіла до збудника | |
| |сифілісу не виявляються.| |
| |Збудники парвовірусу В19| |
| |не виявляються. | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|рН. |6.5-7.7. |За п. 3.3., |
| | |потенціометрично, |
| | |ДФУ, 1 вид. |
| | |р. 2.2.3. |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Вміст білку. |Не менше 4,5%. |За п. 3.4., |
| | |спектрофотометрично|
| | |злита плазма |
| | |(гомогенний пул) |
| | |при проведенні |
| | |операційного |
| | |контролю. |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Колірність |Не більше 0.25 ОО при |За п. 3.5., |
|(гемпігменти) |403 нм. |спектрофотометрично|
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Фактор VIII. |Не менше 0.7 УО/мл |За п. 3.6. Злита |
| |(70%). |плазма (пул не |
| | |менше ніж з |
| | |10 одиниць) при |
| | |проведенні |
| | |операційного |
| | |контролю |
------------------------------------------------------------------
2.2. Заморожена плазма
Специфікація
------------------------------------------------------------------
| Найменування | Встановлені значення | Метод контролю |
|показників контролю| | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
| 1 | 2 | 3 |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Опис. |В замороженому стані - |За п. 3.1, |
| |щільна затверділа маса |візуально Для |
| |жовтуватого або з |кожної порції |
| |зеленуватим відтінком |плазми |
| |кольору. | |
| | | |
| |В рідкому стані - | |
| |прозора або злегка | |
| |мутна рідина без явних | |
| |ознак гемолізу від | |
| |світло жовтого до | |
| |кольору з зеленуватим | |
| |відтінком. | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Відсутність |Антитіла до ВІЛ 1 та 2 -|За п. 3.2. Для |
|інфекцій, що |не виявляються. |кожної порції |
|переносяться при |Антитіла до гепатиту С -|плазми результати |
|гемотрансфузіях. |не виявляються. |обстеження донорів |
| |Поверхневий антиген |на СПК. |
| |вірусу гепатиту В | |
| |(HBsAg) та cor-антитіла | |
| |до вірусу гепатиту В не | |
| |виявляються. | |
| |Антитіла до збудника | |
| |сифілісу не виявляються.| |
| |Збудники парвовірусу В19| |
| |не виявляються. | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|рН. |6.5-7.7. |За п. 3.3., |
| | |потенціометрично, |
| | |ДФУ, 1 вид. |
| | |р. 2.2.3. |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Вміст білка. |Не менше 4,5%. |За п. 3.4., |
| | |спектрофотометрично|
| | |злита плазма |
| | |(гомогенний пул) |
| | |при проведенні |
| | |операційного |
| | |контролю |
------------------------------------------------------------------
3. Методи контролю
3.1. Опис. В замороженому стані - щільна затверділа маса жовтуватого або з зеленуватим відтінком кольору.
В рідкому стані - прозора або злегка мутна рідина без явних ознак гемолізу від світло-жовтого до кольору з зеленуватим відтінком.
3.2. Відсутність інфекцій, що переносяться при гемотрансфузіях.
В плазмі не виявляються антитіла до ВІЛ 1 та 2, антитіла до гепатиту С, поверхневий антиген вірусу гепатиту В (HBsAg) та cor-антитіла до вірусу гепатиту В, збудника сифілісу, не виявляються збудники парвовірусу В19.
Визначення проводять імуноферментним методом з використанням комерційних вітчизняних чи зарубіжних тест-систем, зареєстрованих в Україні, відповідно до вимог інструкції по використанню.
Визначення антитіл до сифілісу, проводять в реакції преципітації або імуноферментним методом з використанням комерційних вітчизняних чи зарубіжних тест-систем, зареєстрованих в Україні, відповідно до вимог інструкції по використанню
3.3. рН. Від 6.5 до 7.7 (потенціометрично, ДФУ, 1 вид. р. 2.2.3).
3.4. Вміст білку. Не менше 4.5%.
В мірну колбу місткістю 25 мл поміщають 1 мл плазми, доводять об'єм розчину 0.9% розчином натрію хлориду Р ізотонічного і перемішують. В пробірку місткістю 20 мл поміщають 1 мл отриманого розчину, додають 4 мл біуретового реактиву і перемішують.
Через 30 хвилин вимірюють оптичну густину розчину на спектрофотометрі при довжині хвилі 540 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи як компенсаційний, розчин, що містить 1 мл 0.9% розчину натрію хлориду Р ізотонічного і 4 мл біуретового реактиву.
Паралельно, в тих же умовах вимірюють оптичну густину розчину, що містить 1 мл РСЗ бичачого сироваткового альбуміну і 4 мл біуретового реактиву.
Вміст білка в плазмі, в процентах, обчислюють за формулою:
Д х С х 100%
1 0
X = ------------------------,
Д
0
Де С - маса наважки БСА, в грамах;
0
Д - оптична густина розчину, що досліджувався;
1
Д - оптична густина розчину БСА.
0
Примітка. Приготування РСЗ бичачого сироваткового альбуміну. 0.15 г бичачого сироваткового альбуміну поміщають в мірну колбу місткістю 25 мл, доводять об'єм розчину 0.9% розчином натрію хлориду Р до позначки і перемішують.
Термін придатності розчину 3 доби при температурі не вище 5 град. С.
3.5. Колірність (гемпігменти). Оптична густина не повинна перевищувати 0.25.
Готують розведення розмороженої плазми 1:4 в в 0.9% розчин натрію хлориду Р.
Вимірюють оптичну густину розчину на спектрофотометрі при довжині хвилі 403 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи в якості компенсаційного розчину ізотонічний 0.9% розчин натрію хлориду Р.
3.6. Фактор VIII. Не менше 0.7 УО/мл (70%). Визначення проводять з використанням набору реагентів для визначення активності фактору VIII "Фактор VIII-тест", НПО "Ренам", або аналогічним.
3.7. Пакування. Пластмасові контейнери для крові та її компонентів, що дозволені до використання у встановленому законодавством порядку. Поліетиленові контейнери в груповій тарі повинні розміщатись горизонтально. Контейнери, заповнені менше ніж на 100 мл, не приймаються.
Маркування. Назва донорського центру, найменування сировини, реєстраційний (індивідуальний) номер донора, дата заготівлі крові, тип і кількість коагулянта, група крові, резус, об'єм в мл, термін та температурний режим зберігання, штриховий код.
Умови зберігання та термін придатності.
Від мінус 30 до мінус 40 град. С - 12 місяців;
мінус 40 град. С і нижче - 24 місяці.
Плазма заморожена може використовуватись для фракціонування, якщо відбулося не більше одного випадку підвищення температури до -5 град. С, не більше, ніж на 72 години.
Перший заступник Голови Державної служби лікарських
засобів і виробів медичного призначення I.Б.Демченко
Затверджено
Наказ Міністерства охорони
здоров'я України
02.06.2005 N 247
Державний Герб України
Медичні імунобіологічні препарати
Настанова з якості
Керівництво по складанню аналітично-нормативної
документації на розчин альбуміну донорського
5, 10 і 20%
Настанова 42-3002-002-2005
Київ
Міністерство охорони здоров'я України
2005
Зміст
1. Сфера застосування та основні вимоги
2. Специфікація
3. Методи контролю
3.1. Опис
3.2. Автентичність
3.3. Прозорість
3.4. Відносна в'язкість
3.5. Кольоровість (гемпігменти)
3.6. Алюміній
3.7. рН
3.8. Об'єм, що витягається
3.9. Стерильність
3.10. Пірогени
3.11. Аномальна токсичність
3.12. Механічні включення
3.13. Термостабільність
3.14. Полімери і агрегати
3.15. Кількісне визначення
3.16. Пакування
3.17. Маркування
1. Сфера застосування та основні вимоги
Це керівництво по складанню аналітично-нормативної документації поширюється на медичний імунобіологічний препарат - Розчин алюбуміну людини 5, 10 і 20%, який являє собою водний розчин альбумінової фракції плазми крові донорів, у відповідності до керівництва по складанню аналітично-нормативної документації на "Плазма людини для фракціонування".
При виготовленні медичних імунобіологічних препаратів виробничі пули плазми повинні перевірятися методом полімеразної ланцюгової реакції на вміст нуклеїнових кислот вірусу гепатиту С, вірусу гепатиту В, парвовірусу В-19, ВІЛ 1, 2.
Як стабілізатор може бути використаний натрій каприловокислий Р (ЄР 1471) з розрахунку 1.5 г на 1 л розчину альбуміну 5%; 3 г на 1 л розчину альбуміну 10%, 6 г на 1 л розчину альбуміну 20%. Антимікробні консерванти не можуть використовуватися на будь якій стадії виробництва препарату.
Розчин пропускають через фільтр, який затримує бактерії та розливають в асептичних умовах в стерильні контейнери (пляшки), які потім укупорюють з метою запобігання забруднення. Препарат в кінцевому пакуванні пастеризують при температурі 60 +- 1.0 град. С не менш ніж 10 годин. Після цього контейнери інкубують при температурі від 30 град. С до 32 град. С не менше, ніж 14 діб або при температурі від 20 град. С до 25 град. С не менше, ніж 4 тижні та візуально контролюють мікробне забруднення.
Розчин альбуміну людини 5, 10 і 20% призначений для застосування як засіб гемодинамічної дії та парентерального живлення.
2. Специфікація
Специфікація
------------------------------------------------------------------
| Найменування | Встановлені значення | Метод контролю |
|показників контролю| | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
| 1 | 2 | 3 |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Опис |Прозора в'язка рідина |За п. 3.1., |
| |від жовтуватого до |візуально. |
| |світло-коричневого | |
| |кольору, допускається | |
| |зеленуватий відтінок. | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Автентичність |А. При |За п. 3.2.А, |
| |електрофоретичному |методом |
| |досліджені основні |електрофорезу ДФУ, |
| |компоненти білкових |1 вид., доп.1, |
| |фракцій повинні бути |р. 2.2.31. |
| |ідентичні за | |
| |електрофоретичною | |
| |рухомістю основним | |
| |білковим фракціям ФСЗ | |
| |ДФУ розчин альбуміну | |
| |людини 10%. | |
| |Б. В препараті повинні |За п. 3.2.Б, |
| |виявлятися тільки білки |методом |
| |крові людини. Білки |імуноелектрофорезу.|
| |тваринного походження | |
| |повинні бути відсутніми.| |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Прозорість |Повинен бути прозорим. |За п. 3.3, ДФУ, 1 |
| | |вид. р. 2.2.1 |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Відносна в'язкість |Для 5% розчину - |За п. 3.4, ДФУ, |
| |не більше 1, |р. 2.2.9. |
| |для 10% розчину - | |
| |не більше 2, | |
| |для 20% розчину - | |
| |не більше 4 | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Кольоровість |Оптична густина не |За п. 3.5, |
|(гемпігменти) |повинна перевищувати |спектрофотометрично|
| |0.15. |ДФУ, р. 2.2.25. |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Алюміній |Не більше 200 мкг/л. |За п. 3.6, ДФУ, 1 |
|Тест виконується, | |вид., метод 1, |
|якщо технологією | |р. 2.2.23 |
|передбачена обробка| | |
|гідроокисом | | |
|алюмінію. | | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|рН |Від 6.7 до 7.3. |За п. 3.7, ДФУ, 1 |
| | |вид. р. 2.2.3 |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Об'єм, що |Повинен відповідати |За п. 3.8, ДФУ, 1 |
|витягається |вимогам ДФУ. |вид. р. 2.9.17 |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Стерильність |Повинен бути стерильним.|За п. 3.9, ДФУ, 1 |
| | |вид. р. 2.6.1 |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Пірогени |Повинен бути |За п. 3.10, ДФУ, 1 |
| |апірогенним. |вид. р. 2.6.8 |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Аномальна |Повинен бути |За п. 3.11, ДФУ, 1 |
|токсичність |нетоксичним. |вид. р. 2.6.9 |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Механічні включення|Повинен відповідати |За п. 3.12. |
| |вимогам РД 42У-001-93. | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Термостабільність |Розчин витримується |За п. 3.13. |
| |50 годин при температурі| |
| |від 56,5 град. С | |
| |до 57,5 град. С. | |
| |Повинен відповідати | |
| |тесту на прозорість. | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Полімери і агрегати|Площа піку (піків), що |За п. 3.14 , ДФУ, 1|
| |виходять перед основним |вид. р. 2.2.29 |
| |піком не повинна | |
| |перевищувати 10% суми | |
| |площ всіх піків на | |
| |хроматограмі (відповідає| |
| |вмісту полімерів та | |
| |агрегатів близько 5%) | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Кількісне | |За п. 13.15 |
|визначення | | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Склад білків |Вміст альбуміну в |За п. 13.15.1, |
|(Альбумін) |препараті має бути не |методом |
| |менше 95%, вміст інших |електрофорезу ДФУ, |
| |білків не більше 5%. |1 вид., доп. 1, |
| | |р. 2.2.31. |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Загальний білок |1 мл препарату вміщує: |За п. 13.15.2 |
| |від 0,045 до 0,055 білку|спектрофотометрично|
| |для розчину альбуміну |(ДФУ, р. 2.2.25), |
| |5%; |або за п. 15.Б, |
| |від 0,09 до 0,11 г |методом визначення |
| |білку для розчину |азоту після |
| |альбуміну 10%; |мінералізації |
| |від 0,180 до 0,220 г |сірчаною кислотою |
| |білку для розчину |(ДФУ 1 вид., р. |
| |альбуміну 20%. |2.5.9) |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Калій-іон |Не більше 0,05 мМоль на |За п. 13.15.3, ДФУ,|
| + |один грам білка. |1 вид. р. 2.2.22 |
|(К ) | | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Натрій-іон |Від 90 мМоль до |За п. 13.15.4 ДФУ, |
| + |160 мМоль. |1 вид. р. 2.2.22 |
|(Na ) | | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Натрій |Від 1.4 до 1.6 г/л для |За п. 13.15.5 Д, |
|каприловокислий |розчину альбуміну 5%; |ДФУ, 1 вид. |
|(октаноат) |від 2.8 до 3.2 г/л для |р. 2.2.29 |
| |розчину альбуміну | |
| |розчину 10%; | |
| |від 5.6 до 6.3 г/л для | |
| |розчину альбуміну 20% | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Зберігання |В сухому, захищеному від| |
| |світла місці при | |
| |температурі від +2 до | |
| |+8 град. С. | |
|-------------------+------------------------+-------------------|
|Термін придатності |За результатами | |
| |визначення стабільності | |
| |при зберіганні | |
------------------------------------------------------------------
3. Методи контролю
3.1. Опис. Прозора в'язка рідина від жовтого до світло-коричневого кольору, допускається зеленуватий відтінок.
3.2. Автентичність:
А) На електрофореграмі досліджуваного препарату, отриманої при кількісному визначенні альбуміну, сновні компоненти білкових фракцій повинні бути ідентичні за електрофоретичною рухомістю основним білковим фракціям ФСЗ ДФУ розчину альбуміну людини 10%.
Б) По 2 мкл препарату поміщають в лунки пластинки з агаровим гелем. Паралельно в одну з лунок поміщають 2 мкл плазми людини.
В електродні камери апарату для електрофорезу наливають барбіталовий буферний розчин рН 8.2 і поміщають пластинки з агаровим гелем. На обидва кінці пластинок поміщають смужки хроматографічного або фільтрувального паперу, розміром 120 х 60 мм, складених у 6 шарів, які з'єднують з електродними камерами. Електрофорез проводять при силі струму 10 мА, напрузі 100 В протягом 1.5 годин.
Після проведення електрофорезу між лунками в агаровому гелі вирізають траншеї (10 х 2 мм), в кожну з них вносять 60 мкл видоспецифічної антисироватки, яка преципітує сироваткові білки людини (ІмБіо, Росія, або аналогічної якості) та сироватки биків, коней (Імтек, Росія або аналогічної якості). Пластинку поміщають в камеру, в яку ставлять бюкс з 100 мл води Р (для зволоження) і декількома кристалами фенолу Р (консервант). Через 24 години пластинку виймають з камери, занурюють в кювету з 250 мл 0.9% розчину натрію хлориду Р, що містить декілька кристалів фенолу Р, і відмивають протягом 2 діб від білку, який не прийняв участі в утворенні преципітату. Розчин замінюють 4 рази на добу.
Відмиту пластинку висушують на повітрі протягом 1 години, занурюють у розчин фарбника амідочорного 10 В на 2 години. Потім пластинку виймають, дають змогу стекти фарбнику і занурюють в 2% розчин кислоти оцтової Р на 2 доби для відмивання від надлишку розчину фарбника. 2% розчин кислоти оцтової Р замінюють 4 рази на добу.
Оцінюють локалізацію і число ліній преципітації препарату відносно ліній преципітації сироватки крові людини, яка повинна проявляти не менше 15 ліній преципітації зі своєю антисироваткою. Між лунками з препаратом і антисироватками до сироваток крові тварин лінії преципітації повинні бути відсутні.
Примітки:
1. Приготування 1.25% агарового гелю. 12.5 г агару (очищеного) поміщають в хімічний стакан місткістю 1 л, додають 500 мл води Р і залишають для набухання гелю протягом 1 годин при температурі від 18 до 20 град. С. Стакан поміщають на водяну баню, що кипить, і витримують до повного розчинення агару. Об'єм розчину гелю доводять водою Р до 500 мл, додають 500 мл барбіталового буферного розчину рН 8.2, перемішують, фільтрують через марлю медичну, складену в 3 шари, додають мертіолят до концентрації 100 мкг/мл і розливають у флакони по 50 мл. Перед використанням агаровий гель розплавляють на водяній бані.
Термін придатності гелю 2 доби.
2. Приготування барбіталового буферного розчину рН 8.2. 47.6 г барбітал-натрію (медінал; 5.5 - диетилбарбітурат натрію) поміщають у колбу місткістю 5 л, додають 69 мл 1 М розчину хлористоводневої кислоти Р, 4.3 л води Р та перемішують до розчинення солей. рН розчину визначають потенціометрично (ДФУ, 1 вид. р. 2.2.3) і при необхідності коригують 1 М розчином хлористоводневої кислоти Р. Термін придатності розчину 3 місяці.
3. Приготування пластинок з агаровим гелем. На скляні пластинки розміром 120 х 90 мм наносять піпеткою 10 мл розплавленого на водяній бані при температурі від 60 до 80 град. С 1.25% агарового гелю і розтирають шпателем до отримання тонкого шару, щоб агаровий гель краще липнув до скла.
Пластинку висушують при температурі від 75 до 80 град. С протягом 5 хвилин.
Потім пластинку поміщають на горизонтальну поверхню і обережно, уникаючи утворення пухирців повітря, наливають 30 мл розплавленого при температурі від 60 до 80 град. С 1.25% агарового гелю до отримання шару товщиною 2-3 мм. Після застигання агарового гелю вирізають 7 лунок діаметром 2-3 мм, використовуючи для цього штамп.
Пластинки використовують протягом 1 доби.
4. Приготування розчину фарбника амідочорного 10 Б. 1.0 г амідочорного 10 Б (Мерк 2005-2007, К N 101167 або аналогічної якості) поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 450 мл 0,1 М розчину оцтової кислоти Р, доводять об'єм розчину 0.1 М розчином натрію ацетату Р до мітки і перемішують.
Термін зберігання розчину 3 місяці.
5. Приготування 2% розчину кислоти оцтової Р. 300 мл води Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, додають 20 мл оцтової кислоти льодяної Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.
Термін зберігання розчину 3 місяці.
6. Приготування 0.9% розчину натрію хлориду Р. 9.0 г натрію хлориду Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 500 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки, перемішують.
Термін зберігання розчину 7 діб.
7. Приготування 0,1 М розчину натрію ацетату Р. 9,8 г натрію ацетату Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 500 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки, перемішують.
Термін зберігання розчину 7 діб.
8. Приготування 0,1 М розчину оцтової кислоти Р. 6 г оцтової кислоти льодяної поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 500 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки, перемішують.
Термін зберігання розчину 7 діб.
3.3. Прозорість. Препарат має бути прозорим в порівнянні з водою Р або ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р або його каламутність не перевищує каламутність еталону каламутності I ДФУ, 1 вид. р. 2.2.1.
3.4. Відносна в'язкість. Для 5% розчину - не більше 1,0; для 10% розчину - не більше 2,0; для 20% розчину - не більше 4,0.
Визначення проводять методом віскозиметрії відповідно до ДФУ 1 видання, р. 2.2.9.
3.5. Кольоровість (гемпігменти). Вимірюють оптичну густину 1% розчину альбуміну на спектрофотометрі при довжині хвилі 403 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи в якості компенсаційного розчину ізотонічний 0.9 % розчин натрію хлориду Р.
Оптична густина не повинна перевищувати 0.15.
3.6. Алюміній. Тест виконується, якщо технологією передбачена обробка гідроокисом алюмінію. Не більше 200 мкг/л. Випробування проводять відповідно ДФУ, 1 вид., метод 1, р. 2.2.23.
3.7. рН. Від 6.7 до 7.3 (потенціометрично, ДФУ, 1 вид. р. 2.2.3). Готують 1% розчин препарату, використовуючи у якості розчинника 0.9% ізотонічний розчин натрію хлориду Р.
3.8. Об'єм, що витягається. Препарат повинен витримувати вимоги ДФУ, 1 вид. р. 2.9.17
3.9. Стерильність. Препарат повинен бути стерильним. Випробування проводять методом мембранної фільтрації відповідно до вимог ДФУ, 1 вид. р. 2.6.1.
Препарат в умовах випробувань не проявляє антимікробної дії.
3.10. Пірогени. Препарат повинен бути апірогенним. Тест-доза становить 5 мл препарату на 1 кг маси кроля.
Вводять внутрішньовенно протягом 2 хвилин. Випробування проводять відповідно до вимог ДФУ, 1 вид. р. 2.6.8.
3.11. Аномальна токсичність. Тест-доза становить 0,5 мл препарату на одну мишу. Вводять внутрішньовенно протягом 5 секунд. Термін спостереження - 3 доби. Випробування проводять відповідно до вимог ДФУ, 1 вид. р. 2.2.6.9.
3.12. Механічні включення. Препарат повинен витримувати вимоги, вказані в Інструкції по контролю лікарських засобів для парентерального застосування на механічні включення (РД 42У-001-93).
3.13. Термостабільність. Розчин витримується 50 годин при температурі від 56,5 град. С до 57,5 град. С. Повинен відповідати тесту на прозорість.
3.14. Полімери і агрегати.
Випробування проводять методом рідинної хроматографії (ДФУ, 1 вид. р. 2.2.29). Площа піку (піків), що виходять перед основним піком не повинна перевищувати 10% суми площ всіх піків на хроматограмі (відповідає вмісту полімерів та агрегатів 5%). Пік стабілізатору (каприлату) в розрахунки не приймають.
По 50 мкл випробуваного розчину і розчину порівняння поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі з УФ-детектором, отримуючи не менше 3 хроматограм кожного з розчинів у наступних умовах:
- колонка TSKgel SW 3000 розміром 75 мм х 60 см, розмір часток 10 мкм, з передколонкою або інша, для якої виконуються вимоги тесту "Перевірка придатності хроматографічної системи";
- рухома фаза: фосфатний буферний розчин, що містить 11,688 г натрію хлориду Р і 50 мг натрію азиду Р на 1 л, дегазована будь-яким зручним способом;
- швидкість рухомої фази: 0.5 мл/хв.;
- детектування при довжині хвилі: 280 нм;
- температура колонки: 30 град. С.
Результати аналізу вважаються достовірними, якщо виконуються вимоги тесту "Перевірка придатності хроматографічної системи".
Примітки:
1. Приготування рухомої фази. У мірній колбі місткістю 1 л зважують 4,873 г натрію дигідрофосфату Р, 1,741 г динатрію гідрофосфату дигідрату Р, 11,688 г натрію хлориду Р і 50 мг натрію азиду Р. Додають 500 мл води Р, обережно збовтують до повного розчинення солей і доводять водою Р до мітки.
Розчин використовують свіжоприготованим.
2. Приготування випробуваного розчину. У пробірку місткістю 30 мл поміщають 1,0 мл препарату і додають 20,0 мл 0,9% розчину натрію хлориду Р.
Розчин використовують свіжоприготованим.
3. Приготування розчину порівняння. 1,0 мл ФСЗ ДФУ розчину альбуміну людського 10% для визначення високомолекулярних домішок поміщають у пробірку місткістю 30 мл і додають 20,0 мл 0,9% розчин натрію хлориду Р.
Розчин використовують свіжоприготованим.
4. Перевірка придатності хроматографічної системи. Хроматографічна система вважається придатною, якщо виконуються наступні умови:
- відносне стандартне відхилення часу утримання піку альбуміну, розраховане з трьох хроматограм розчину порівняння, не перевищує 1,0%;
- відносне стандартне відхилення площі піку (піків) високомолекулярних домішок, розраховане з трьох хроматограм розчину порівняння, не перевищує 5,0%.
3.15. Кількісне визначення:
3.15.1. Білковий склад. (Альбумін) Випробовування проводять методом зонного електрофорезу (ДФУ, р. 2.2.31). Препарат розводять 0.9% розчином натрію хлориду Р до концентрації білка 2.0%. В електродні секції розділювальної камери апарату для електрофорезу на попередньо підготовані плівки із ацетату целюлози наливають барбіталовий буферний розчин рН 8.4 до риски, що позначена на камері. 4 мкл випробуваного розчину препарату наносять на зволожені плівки розміром 90 х 90 мм, які заправлені в спеціальні рамки. Паралельно для ідентифікації фракцій наносять ФСЗ ДФУ розчин альбуміну людини 10% підготовленого аналогічно випробуваному розчину. Попередньо зразки фарбують розчином бромфенолового синього Р, що дозволяє контролювати нанесення проб і рух фракцій.
Рамки поміщають в камері так, щоб лінія нанесення проб знаходилась ближче до катоду. Камеру закривають кришкою, включають джерело живлення (сила струму від 8 до 10 мА, напруга 110 В). Розділення проводять від 30 до 40 хвилин. Потім прилад вимикають. Рамки з плівками виймають із камери і підсушують на повітрі протягом 10 хвилин. Плівки виймають із рамок пінцетом, уникаючи контакту з ділянками, де проходив електрофорез препарату.
Плівки відрізають з двох сторін (близько 2.5 мм), поміщають в кювету з 50 мл розчину фарбника амідочорного 10 Б і витримують протягом 5 хвилин. Плівку виймають із кювети, дають час на стікання надлишкової рідини і почергово на 5 хвилин поміщають в три кювети, які містять по 100 мл розчину для відмивання електрофореграм. Фон плівки після відмивання повинен бути білого кольору. Потім плівку промивають водою Р і сушать між листами фільтрувального паперу.
Ідентифікацію білкових фракцій препарату проводять шляхом порівняння його електрофореграми з електрофореграмою ФСЗ ДФУ розчин альбуміну людини 10%, отриманої при цьому ж розділенні.
Кількісне визначення альбуміну проводять:
- шляхом обробки електрофореграм методом денситометрування (TotaLab v2.01, Amersham Parmacia, США, або з використанням аналогічного обладнання);
- елюції його з плівки з наступним спектрофотометруванням двох паралельних нанесень:
Для елювання фракцій плівку розрізають на окремі електрофореграми. Вирізають окремі фракції з препаратом, поміщають кожний відрізок у пробірку і додають 3 мл елюючого розчину. Елюцію проводять в темному місці протягом 40 хвилин при багаторазовому струшуванні. Вимірюють оптичну густину елюату на спектрофотометрі при довжині хвилі 620 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи в якості компенсаційного розчину елюат незафарбованої ділянки електрофореграми. Суму значень оптичної густини приймають за 100% і розраховують який процент по відношенню до неї складає оптична густина кожної фракції.
Вміст альбуміну в препараті має бути не менше 95%, вміст інших білків - не більше 5%.
Примітки:
1. Підготовка плівки. В кювету поміщають 100 мл барбіталового буферного розчину рН 8.4, потім на поверхню буферного розчину гладкою стороною кладуть плівку із ацетату целюлози, витримують протягом 2 хвилин, після чого її поміщають за допомогою пінцету на дно кювети і витримують протягом 2 хвилин. Плівку виймають пінцетом, надлишок вологи видаляють, промокнувши її поміж двох листів фільтрувального паперу. На зволоженій плівці з матової сторони формують стартові канавки.
Плівки використовують свіжоприготовані.
2. Приготування барбіталового буферного розчину рН 8.4. 8.5 г барбітал-натрію (медінал; 5.5 - диетилбарбітурат натрію) поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розводять в 600 мл води Р, додають 10 мл 1 М розчину хлористоводневої кислоти Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.
Термін придатності розчину 3 місяці.
3. Приготування розчину бромфенолового синього. 0.05 г бромфенолового синього Р поміщають у мірну колбу місткістю 100 мл, розчиняють у 2.0 мл оцтової кислоти льодяної, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.
Термін придатності розчину 6 місяців.
4. Приготування розчину фарбника амідочорного 10 Б. 0.5 г амідочорного 10 Б (Мерк 2005-2007, К N 101167 або аналогічної якості) поміщають в колбу місткістю 250 мл, додають 10 мл кислоти оцтової льодяної Р, 3 г кислоти трихлороцтової Р, 90 мл 96% спирту Р і перемішують. Суміш залишають на 24 години, періодично струшуючи.
Термін придатності розчину 6 місяців.
5. Приготування розчину для відмивки електрофореграм.
700 мл води Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, додають 40 мл кислоти оцтової льодяної Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.
Термін придатності розчину 6 місяців.
6. Приготування елюючого розчину. 50 мл 0,1 М розчину натрію гідроксиду Р поміщають у колбу місткістю 100 мл, додають 5 мл 0,1 М розчину натрію едетату Р і перемішують.
Термін придатності розчину 3 місяці.
3.15.2. Загальний білок.
Метод А. Готують 0.2% розчин препарату, використовуючи як розчинник 0.9% розчин натрію хлориду Р. 5.0 мл отриманого розчину поміщають в пробірку місткістю 20 мл, додають 5.0 мл біуретового реактиву Р і перемішують.
Через 30 хвилин вимірюють оптичну густину отриманого розчину на спектрофотометрі при довжині хвилі 540 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи в якості компенсаційного розчину розчин, що містить 5.0 мл 0.9% розчину натрію хлориду Р і 5.0 мл біуретового реактиву Р.
Паралельно аналогічно розчину, що випробовується, в тих же умовах вимірюють оптичну густину розчину, що містить 5.0 мл розчину порівняння і 5.0 мл біуретового реактиву Р, використовуючи в якості компенсаційного розчину розчин, що містить 5.0 мл 0.9% розчину натрію хлориду Р і 5.0 мл біуретового реактиву.
Вміст білку (X) в 1 мл препарату, в грамах, розраховують за формулою:
А х 1 х 5 х а х Р А х а х Р
1 1
X = ------------------- = --------------
А х S х 50 х 5 А х S х 50
0 0
де:
Р - вміст білку в ФСЗ розчин альбуміну людини 10%, в грамах в
1 мл;
А - оптична густина випробовуваного розчину;
1
А - оптична густина розчину порівняння;
0
а - розведення препарату при приготування випробуваного
розчину.
S - кількість препарату, взятого для приготування
випробуваного розчину, мл.
Примітка. Приготування розчину порівняння. 1.0 мл ФСЗ ДФУ розчин альбуміну людини 10% поміщають в мірну колбу місткістю 50 мл, доводять об'єм розчину 0.9% розчином натрію хлориду Р до мітки і перемішують.
Термін придатності розчину 2 доби при температурі від 4 до 8 град. С.
Метод Б. Препарат розводять 0.9% розчином натрію хлориду Р до концентрації білка близько 15 мг в 2 мл. 2 мл приготовленого розчину поміщають в центрифужну пробірку і додають 2 мл розчину 75 г/л молибдату натрія Р і 2 мл суміші одного об'єму без азотної кислоти сірчаної Р і 30 об'ємів води Р. Обережно струшують та центрифугують 20 хвилин при 6000 об/хв. Над осадову рідину зливають, пробірку перевертають на фільтрувальний папір для дренування.
Визначають азот після мінералізації сірчаною кислотою згідно ДФУ 1 вид., р. 2.5.9. Кількість білка розраховують, помноживши кількість азоту на 6,25.
1 мл препарату повинен містити:
від 0.045 до 0.055 білку для альбуміну розчину 5%;
від 0.09 до 0.11 г білку для альбуміну розчину 10%;
від 0.150 до 0.250 г білку для альбуміну розчину 20%.
3.15.3. Калій-іон. Випробування проводять згідно ДФУ, 1 вид. р. 2.2.22, вимірюючи інтенсивність емісії при 589 нм або нижченаведеним методом.
1.0 мл препарату поміщають в мірну колбу місткістю 100 мл, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують. Вимірюють емісію отриманого розчину на полум'яному фотометрі типу ПАЖ, проводячи не менше 5 паралельних вимірювань. Калібровку приладу проводять як описано в примітках до п. 17.
Виходячи з калібровки розраховують вміст калій-іону (X ) у
К
випробуваному розчині, в ммоль/мл препарату. Вміст калій-іону
(X ) в препараті, в ммоль/л, розраховують за формулою:
К, ммоль/мл,
X
К
X = -------.
К, ммоль/мл, 100
Розраховують вміст калій-іону (X ), в ммоль/г білка,
К, ммоль/г
за формулою:
X
К, ммоль/мл
X , ммоль/г = ------------;
К X
Б, г/мл
де:
X - вміст білка в препараті, в г/мл.
Б, г/мл
Вміст калій-іону (К+ ) в 1 мл препарату повинен бути не більше 0.05 мМоль.
3.15.4. Натрій-іон. Випробування проводять згідно ДФУ, 1 вид. р. 2.2.22, вимірюючи інтенсивність емісії при 589 нм або нижченаведеним методом.
10,0 мл препарату поміщають в мірну колбу місткістю 100 мл, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують. 1,0 мл отриманого розчину поміщають в мірну колбу місткістю 100 мл, доводять об'єм розчину до мітки і перемішують. Вимірюють емісію отриманого розчину на полум'яному фотометрі типу ПАЖ, проводячи не менше 5 паралельних вимірювань. Калібровку приладу проводять як описано в примітках.
Виходячи з калібровки розраховують вміст натрій-іону (X ) у
Na
випробуваному розчині, в ммоль/л.
Вміст натрій-іону (X ) в препараті, в ммоль/л,
Na, ммоль/л,
розраховують за формулою:
X х 10 х 1 X
Na Na
X = ------------- = -------;
Na, ммоль/л 100 х 100 1000
+
Вміст натрій-іону (Na ) в 1 л препарату повинен бути не
меншим 90 мМоль та більше 160 мМоль.
Примітки:
1. Підготовка до проведення випробування на полум'яному фотометрі. Перед випробуванням проводять калібровку приладу по розчинам порівняння К1, К2, К3, К4, К5 для визначення калій-іону або Na1, Na2, Na3, Na4, Na5 для визначення натрій-іону у відповідності з інструкцією до приладу. Результати калібровки виражають в ммоль/мл для калій-іону та в в ммоль/л для натрій-іону. Розраховують вміст калій-іону у відповідній наважці калія хлориду, використовуваючи коефіцієнт 0,524. Розраховують вміст натрій-іону у відповідній наважці натрію хлориду, використовуваючи коефіцієнт 0,393.
2. Приготування розчинів порівняння для визначення калій-іону. 0.31 г (точна наважка) калію хлориду Р і 7.8 г (точна наважка) натрію хлориду Р поміщають в мірну колбу місткістю 250 мл, розчиняють в 100 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують. 10.0 мл отриманого розчину поміщають в мірну колбу місткістю 100 мл, доводять об'єм розчину водою Р до мітки та перемішують (розчин А).
Термін придатності розчину А 1 місяць.
1.0 мл, 2.0 мл, 3.0 мл, 4.0 мл і 5.0 мл розчину А поміщають в мірні колби місткістю 100 мл, доводять об'єми розчинів водою Р до мітки і перемішують, отримуючи розчини порівняння К1, К2, К3, К4, К5 з концентрацією калію 0.17 мМоль; 0.33 мМоль; 0.50 мМоль; 0.067 мМоль і 0.83 мМоль відповідно.
Термін придатності розчинів 1 доба.
3. Приготування розчинів порівняння для визначення натрій-іону. 2.0 мл, 4.0 мл, 5.0 мл, 6.0 мл і 8.0 мл розчину порівняння К3 для визначення калій-іону поміщають у мірні колби місткістю 50 мл, доводять об'єми розчинів водою Р до мітки і перемішують, отримуючи розчини порівняння Na1, Na2, Na3, Na4, Na5 з концентрацією натрію 0.64 мМоль; 1.28 мМоль; 1.6 мМоль; 1.92 мМоль і 2.56 мМоль відповідно.
Термін придатності розчинів 1 доба.
3.15.5. Натрій каприловокислий (октаноат). Вміст натрію каприловокислого (октаноату):
від 1.4 до 1.6 г/л для розчину альбуміну 5%;
від 2.8 до 3.2 г/л для розчину альбуміну розчину 10%;
від 5.6 до 6.3 г/л для розчину альбуміну 20%.
Виначення проводять методом рідинної хроматографії (2.2.29).
По 10 мкл розчину препарату і розчину порівняння поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі з УФ-детектором, одержуючі не менше ніж 3 хроматограми кожного з розчинів, у наступних умовах:
- колонка з нерухомою фазою октадецилсилил силікагель (С18), розміром 250 х 4.6 мм, з розміром часток 5 мкм або аналогічна, для якої виконуються умови тесту "Перевірка придатності хроматографічної системи";
- детектування при довжині хвилі 210 нм;
- температура колонки: 40 град. С;
- рухома фаза А: ацетатний буферний розчин;
Б: ацетонітрил для хроматографії Р1 : фосфатний буферний розчин (9:1)
С: ацетонітрил для хроматографії Р1 : 1% кислота трифтороцтова (9:1)
- програма градієнта:
------------------------------------------------------------------
|Час, хв. | Рухома | Рухома | Рухома |Швидкість | Коментар |
| |фаза А, %| фаза В, |фаза С, | потоку, | |
| | об. | % об. | % об. | мл/хв. | |
|---------+---------+---------+--------+----------+--------------|
|0.0-25.0 | 65 -> 0 |35 -> 100| 0 | 0.7 | Лінійний |
| | | | | | градієнт |
|---------+---------+---------+--------+----------+--------------|
|25.0-35.0| 0 | 100 | 0 | 0.7 | Ізократичний |
| | | | | | градієнт |
|---------+---------+---------+--------+----------+--------------|
|35.0-45.0| 0 | 0 | 100 | 0.7 | Видалення |
| | | | | | білка * |
|---------+---------+---------+--------+----------+--------------|
|45.0-55.0| 65 | 35 | 0 | 0.5 | Повернення до|
| | | | | | вихідних умов|
|---------+---------+---------+--------+----------+--------------|
|55.0-57.0| 65 | 35 | 0 | 0.7 | Стабілізація |
| | | | | | тиску |
------------------------------------------------------------------
* На цій стадії обертають потік через колонку в протилежну сторону.
Хроматограму записують 35 хвилин.
Розрахунок вмісту натрію каприловокислого (октаноату) (у г/л) проводять за формулою:
m х S х 10
0
X = -------------
S
0
де,
m0 - маса наважки, г
S0 - середнє значення площ піків натрію каприловокислого, розраховане з хроматограм розчину порівняння;
S - середнє значення площ піків натрію каприловокислого, розраховане з хроматограм розчину препарату;
10 - коефіцієнт перерахування в літри.
Результати аналізу вважаються достовірними, якщо виконуються вимоги тесту "Перевірка придатності хроматографічної системи".
Примітки:
1. Приготування розчину порівняння. Близько 0.15 г (точна наважка) октаноата натрію для розчину альбуміну 5%; 0.3 г (точна наважка) октаноата натрію для розчину альбуміну 10%; 0.6 г (точна наважка) октаноата натрію для розчину альбуміну 20% поміщають у мірну колбу місткістю 100 мл, розчиняють у 50 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують. Розчин використовують свіжоприготованим.
2. Приготування рухомої фази А. 1.5 г натрію ацетату Р поміщають у колбу місткістю 1 л, розчиняють у воді для хроматографії Р, доводять об'єм розчину до 1 л. По краплях додають кислоту оцтову Р до рН від 2.9 до 3.1. Розчин фільтрують через мембрану з діаметром пор 0.45 мкм і дегазують будь-яким зручним способом. Термін придатності розчину - 3 доби.
3. Приготування рухомої фази Б. 50 мл рухомої фази А поміщають у мірний циліндр місткістю 500 мл, додають 1 мл кислоти оцтової Р і доводять об'єм ацетонітрилом для хроматографії Р1 до 500 мл. Термін придатності розчину - 1 міс.
4. Приготування рухомої фази С. У колбу місткістю 50 мл поміщають 0.5 мл кислоти трифтороцтової, розчиняють у 20 мл води для хроматографії Р, доводять об'єм до 50 мл водою для хроматографії Р і перемішують. 50 мл отриманого розчину поміщають у мірний циліндр місткістю 500 мл і доводять об'єм ацетонітрилом для хроматографії Р до 500 мл.
Термін придатності розчину - 1 міс.
5. Перевірка придатності хроматографічної системи. Хроматографічна система вважається придатної, якщо виконуються наступні вимоги:
- ефективність хроматографічної колонки, розрахована по піку натрію каприловокислого з хроматограми розчину порівняння, повинна бути не менше 20 000 теоретичних тарілок;
- коефіцієнт симетрії піка натрію каприловокислого з хроматограми розчину порівняння, повинен бути не менш 0.7 і не більше 1.5;
- відносне стандартне відхилення площ піків натрію каприловокислого, розраховане з трьох хроматограм розчину порівняння, не повинне перевищувати 2%.
3.16. Пакування. По 10, 20, 50, 100, 250 або 400 мл в пляшки скляні у відповідності до вимог ДФУ, вид. 1, доповнення 1, р. 3.2.1. Закорковані гумовими закупорювальними засобами для контейнерів з водними лікарськими засобами для парентерального застосування, для порошків і ліофілізованих продуктів у відповідності до вимог ДФУ, вид. 1, р. 3.2.9 і обтисненні ковпачками алюмінієвими типу К-1, К-3 та К-5 за ТУ У 14257180.003-98 або за ТУ У 30883300.001-2000.
На пляшки наклеюють етикетки із паперу етикеткового або для письма.
Кожну пляшку разом з інструкцією по застосуванню пакують в індивідуальну пачку з картону.
За домовленості із споживачем пляшки можуть пакуватися в групову тару без використання індивідуальних пачок.
На пачку наклеюють етикетку із паперу етикеткового або для письма або ж текст етикетки наносять на пачку друкарським способом.
3.17. Маркування. На етикетці і пачці українською або українською та російською мовою вказують: найменування підприємства-виробника, його товарний знак та адресу; назву препарату українською мовою та латиною або українською, російською мовою та латиною; концентрацію альбуміну людини у відсотках; об'єм препарату в мілілітрах; вміст іонів натрію та калію; умови зберігання, номер серії, реєстраційний номер, термін придатності, штриховий код. Маркування передбачає нанесення написів: "Стерильно"; "Застосовувати за призначенням лікаря".
Номер серії та термін придатності препарату дозволяться наносити на бічній стороні пачки методом тиснення.
На етикетці групової тари додатково вказують кількість пакувань.
Транспортне маркування відповідно до ГОСТ 14192-96.
Транспортування. Всіма видами критого транспорту при температурі від 2 до 8 град. С.
Зберігання. У сухому, захищеному від світла місці при температурі від 2 до 8 град. С.
Термін придатності. За результатами вивчення стабільності
Примітка. Реактиви, титровані розчини і індикатори, наведені в даному керівництві, описані у ДФУ, 1 вид.
Перший заступник Голови Державної служби
лікарських засобів і виробів медичного призначення I.Б.Демченко
Затверджено
Наказ Міністерства охорони
здоров'я України
02.06.2005 N 247
Державний Герб України
Медичні імунобіологічні препарати
Настанова з якості
Керівництво по складанню аналітично-нормативної
документації на імуноглобулін людини нормальний,
рідкий
Настанова 42-3002-003-2005
Київ
Міністерство охорони здоров'я України
2005
Зміст
1. Сфера застосування та основні вимоги
2. Специфікація
3. Методи контролю
3.1. Опис
3.2. Автентичність (ідентифікація)
3.3. Прозорість
3.4. Кольоровість
3.5. Механічні включення
3.6. рН
3.7. Білок
3.8. Склад білків. (Електрофоретична однорідність)
3.9. Фракційний склад
3.10. Гліцин
3.11. Молекулярні параметри
3.12. Об'єм, що витягається
3.13. Стерильність
3.14. Пірогенність
3.15. Аномальна токсичність
3.16. Специфічна безпечність
3.17. Кількісне визначення специфічної активності
1. Сфера застосування та основні вимоги
Це керівництво по складанню аналітично-нормативної документації поширюється на медичний імунобіологічний препарат Імуноглобулін людини нормальний, рідкий, що містить імуноглобуліни, переважно імуноглобулін G (IgG). Допускається присутність інших білків. Імуноглобулін людини нормальний містить антитіла G (IgG) нормальної людини. Препарат призначений для внутрішньом'язевого введення. Імуноглобулін людини нормальний отримують з плазми, яка відповідає вимогам нормативного документу "Плазма людини для фракціонування".
Імуноглобулін людини нормальний виробляють із суміші плазми або сироватки людини від не менше як 1000 донорів. При виготовленні препарату виробничі пули плазми повинні перевірятися методом полімеразної ланцюгової реакції на вміст нуклеїнових кислот вірусу гепатиту С, вірусу гепатиту В, парвовірусу В-19, ВІЛ 1 та 2.
Імуноглобулінову фракцію білків сироватки або плазми крові донорів виділяють, очищують і концентрують методом фракціонування спиртоводними осадниками при температурі нижче 0 град. С.
Кінцевий продукт:
- не переносить інфекцій;
- при концентрації білку 0,1 грам в одному мілілітрі містить відповідно до Міжнародного стандарту або стандартного препарату не менше двох типів антитіл (одне вірусне, одне бактеріальне).
Імуноглобулін людини нормальний виробляється як стабілізований розчин, наприклад в розчині 9 г/л розчину хлориду натрію, 22.5 г/л розчину гліцину. Розчин імуноглобуліну фільтрують в асептичних умовах через стерилізуючий фільтр з діаметром пор не більше 0.22 мкм.
Стабільність препарату підтверджується відповідними дослідженнями, які тривають протягом етапів розробки.
Засіб для профілактики вірусного гепатиту А, кору, кашлюку, менінгококової інфекції, поліомієліту, лікування гіпо- і агамаглобулінемій, для підвищення імунного статусу в період реконвалесценції при деяких інфекційних і неінфекційних захворюваннях.
2. Специфікація
Специфікація
------------------------------------------------------------------
| Найменування | Встановлене значення | Метод контролю |
|показників контролю | | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
| 1 | 2 | 3 |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Опис |Прозора або злегка |За п. 3.1, |
| |опалесцююча, безбарвна |візуально |
| |або жовтувата рідина. У| |
| |процесі зберігання | |
| |можлива поява | |
| |незначного осаду, що | |
| |зникає при струшуванні.| |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Автентичність |А. При |За п. 3.2.А, |
|(ідентифікація) |електрофоретичному |методом |
| |досліджені основні |електрофорезу, ДФУ,|
| |компоненти білкових |1 вид., доп. 1, |
| |фракцій повинні бути |р. 2.2.31. |
| |ідентичні за | |
| |електрофоретичною | |
| |рухомістю основним | |
| |білковим фракціям ФСЗ | |
| |ДФУ розчину | |
| |імуноглобуліну. | |
| |Б. В препараті повинні |За п. 3.2.Б, |
| |виявлятися тільки білки|методом |
| |крові людини. Білки |імуноелектрофорезу.|
| |тваринного походження | |
| |повинні бути | |
| |відсутніми. | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Прозорість |Оптична густина не |За п. 3.3, |
| |повинна перевищувати |спектрофотометрично|
| |0.165. |ДФУ, р. 2.2.25. |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Кольоровість |Оптична густина не |За п. 3.4, |
| |повинна перевищувати |спектрофотометрично|
| |0.5. |ДФУ, р. 2.2.25. |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Механічні включення |Препарат має |За п.3.5. |
| |відповідати вимогам | |
| |РД 42У-001-93. | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|рН |Від 5.0 до 7.2. |За п.3.6, |
| | |потенціометрично, |
| | |ДФУ, 1 вид. |
| | |р. 2.2.3 |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Білок |Від 0.09 до 0.11 г |За п. 3.7.А, |
| |білку в 1 мл |спектрофотометрично|
| | |(ДФУ, р. 2.2.25), |
| | |або за п. 3.7 Б, |
| | |методом визначення |
| | |азоту після |
| | |мінералізації |
| | |сірчаною кислотою |
| | |(ДФУ 1 вид., |
| | |р. 2.5.9) |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Склад білків. |Імуноглобуліну не менше|За п.3.8, методом |
|Електрофоретична |95% від загального |зонального |
|однорідність |білку. |електрофорезу ДФУ, |
| | |1 вид., доп. 1, |
| | |р. 2.2.31. |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Фракційний склад |На імунофореграмі |За п.3.9, методом |
| |повинна виявлятися |імуноелектрофорезу.|
| |інтенсивна дуга | |
| |преципітації Ig G та не| |
| |більше 4 додаткових | |
| |дуг, що відповідають Ig| |
| |А, Ig М, та двом іншим | |
| |імунологічно неактивним| |
| |фракціям | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Гліцин |1.5-3.0% |Випробування |
| | |проводять методом |
| | |рідинної |
| | |хроматографії (ДФУ,|
| | |1 вид. р. 2.2.29). |
| | |За п. 3.10, ДФУ. |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Молекулярні |Вміст фракцій: полімери|За п. 3.11, ДФУ, 1 |
|параметри |та агрегати - не більше|вид. р. 2.2.29 |
| |10%, мономери та | |
| |дімери - не менше 85%. | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Об'єм, що |Препарат повинен |За п. 3.12, ДФУ, 1 |
|витягається |відповідати вимогам ДФУ|вид., р. 2.9.17 |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Стерильність |Повинен бути |За п. 3.13, ДФУ, 1 |
| |стерильним. |вид., р. 2.6.1 |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Пірогенність |Повинен бути |За п. 3.14, ДФУ, 1 |
| |апірогенним. |вид., р. 2.6.8 |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Аномальна |Повинен витримувати |За п. 3.15, ДФУ, 1 |
|токсичність |випробування |вид., р. 2.6.9 |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Специфічна |Не повинен містити |За п. 3.16.1 |
|безпечність |поверхневого антигену |імуноферментним |
|Контроль на |вірусу гепатиту В. |методами. |
|відсутність HBsAg | | |
| |Не повинен містити |За п. 3.16.2, |
|Контроль на |антитіл до вірусу |імуноферментним |
|відсутність антитіл |імунодефіциту |методом. |
|до ВІЛ-1, ВІЛ-2 |людини 1 та 2 типів. | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Кількісне визначення|1 мл препарату повинен |За п.3.17.1 |
|специфічної |містити не менш 5 МО | |
|активності |антиальфастафілолізина.| |
|Визначення | | |
|антиальфастафіло- | | |
|лізина | | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Визначення антитіл |У препараті повинно |За п. 3.17.2, за |
|до вірусу кору |бути не менш 1:480 |допомогою |
| |антитіл до вірусу кору |комерційного |
| |в титрі (не менше |еритроцитарного |
| |37,5 МО на 1 мл). |корового |
| | |антигенного сухого |
| | |діагностикуму в |
| | |реакції пасивної |
| | |гемаглютинації |
| | |(РПГА) відповідно |
| | |до інструкції по |
| | |застосуванню |
| | |діагностикуму. |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Зберігання |В сухому, захищеному | |
| |від світла місці при | |
| |температурі від 2 до | |
| |8 град. С. | |
------------------------------------------------------------------
3. Методи контролю
3.1. Опис. Прозора або злегка опалесцююча, безбарвна або жовтувата рідина. У процесі зберігання можлива поява незначного осаду, що зникає при струшуванні.
3.2. Автентичність (ідентифікація):
А) На електрофореграмі досліджуваного препарату, отриманої при електрофоретичному визначенні імуноглобуліну, основні компоненти білкових фракцій повинні бути ідентичні за електрофоретичною рухомістю основним білковим фракціям ФСЗ ДФУ розчину імуноглобуліну людини 10%.
Б) У препараті повинні виявлятися білки, властиві тільки плазмі або сироватці крові людини, і відсутні білки тваринного походження. Визначення проводять методом імуноелектрофорезу відповідно до розділу "фракційний склад".
3.3. Прозорість. Вимірюють оптичну густину препарату на спектрофотометрі при довжині хвилі 540 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм. (ДФУ, 1 вид. і Доповнення 1, р. 2.2.25).
Оптична густина не повинна перевищувати 0.165.
3.4. Кольоровість. Вимірюють оптичну густину препарату на спектрофотометрі при довжині хвилі 400 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм. (ДФУ, 1 вид. і Доповнення 1, р. 2.2.25).
Оптична густина не повинна перевищувати 0.5.
3.5. Механічні включення. Препарат має відповідати вимогам, зазначеним в Інструкції з контролю лікарських засобів для парентерального застосування на механічні включення (РД 42У-001-93).
3.6. рН. Від 5.0 до 7.2. Готують розведення препарату 9% розчином натрію хлориду Р до концентрації білку 10 г/л. Визначення проводять потенціометрично, ГФ X1, вип. 1, с. 113.
3.7. Білок. 1 мл препарату повинен містити від 0.09 до 0.11 г білку.
Метод А. 1 мл препарату поміщають в мірну колбу місткістю 50 мл, доводять об'єм розчину ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р, перемішують 5.0 мл отриманого розчину, поміщають в пробірку місткістю 20 мл, додають 5.0 мл біуретового реактиву Р і перемішують.
Через 30 хв вимірюють оптичну густину отриманого розчину на спектрофотометрі при довжині хвилі 540 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи в якості компенсаційного розчину розчин, що містить 5.0 мл ізотонічного 0.9% розчину натрію хлориду Р і 5.0 мл біуретового реактиву Р.
Паралельно, аналогічно випробуваному розчину, в тих же умовах вимірюють оптичну густину розчину, що містить 5.0 мл розчину порівняння і 5.0 мл біуретового реактиву Р, використовуючи в якості компенсаційного розчину розчин, що містить 5.0 мл ізотонічного 0.9% розчину натрію хлориду Р і 5.0 мл біуретового реактиву.
Вміст білку (X) в 1 мл препарату, в грамах, розраховують за формулою:
D х С х 1 х 50 х 5 D х С
1 1
X = --------------------- = --------
D х 1 х 50 х 5 D
0 0
де:
С - вміст білку в ФСЗ розчину імуноглобуліну людини 10%, в
грамах в 1 мл;
D - оптична густина випробуваного розчину;
1
D - оптична густина розчину порівняння
0
1 мл препарату повинен містити від 0.09 до 0.11 г білку.
Примітка. Приготування розчину порівняння. 1.0 мл ФСЗ ДФУ розчину імуноглобуліну 10% поміщають в мірну колбу місткістю 50 мл, доводять об'єм розчину ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р до мітки і перемішують.
Термін придатності розчину 2 доби при температурі (6 +- 2) град. С.
Метод Б. Препарат розводять 0.9% розчином натрію хлориду Р до концентрації білка близько 15 мг в 2 мл. 2 мл приготовленого розчину поміщають в центрифужну пробірку і додають 2 мл розчину 75 г/л молібдату натрію Р і 2 мл суміші одного об'єму без азотної кислоти сірчаної Р і 30 об'ємів води Р. Обережно струшують та центрифугують 20 хвилин при 6000 об/хв. Надосадову рідину зливають, пробірку перевертають на фільтрувальний папір для дренування.
Визначають азот після мінералізації сірчаною кислотою згідно ДФУ 1 вид., р. 2.5.9. Кількість білка розраховують, помноживши кількість азоту на 6.25.
3.8. Склад білків. (Електрофоретична однорідність). Фракція імуноглобуліну повинна складати не менше 95% від загального білку.
В електродні секції розділювальної камери апарату для електрофорезу на попередньо підготовані плівки із ацетату целюлози наливають барбіталовий буферний розчин рН 8.4 до риски, що позначена на камері. 4 мкл препарату наносять на зволожені плівки розміром 90 х 90 мм, які заправлені в спеціальні рамки. Паралельно для ідентифікації фракцій наносять ФСЗ ДФУ розчину імуноглобуліну людини 10%. Попередньо зразки фарбують розчином бромфенолового синього Р, що дозволяє контролювати нанесення проб і рух фракцій.
Рамки поміщають в камері так, щоб лінія нанесення проб знаходилась ближче до катоду. Камеру закривають кришкою, включають джерело живлення (сила струму від 8 до 10 мА, напруга 110 В). Розділення проводять від 30 до 40 хвилин. Потім прилад вимикають. Рамки з плівками виймають із камери і підсушують на повітрі протягом 10 хвилин. Плівки виймають із рамок пінцетом, уникаючи контакту з ділянками, де проходив електрофорез препарату.
Плівки відрізають з двох сторін (близько 2.5 мм), поміщають в кювету з 50 мл розчину фарбника амідочорного 10 Б і витримують протягом 5 хвилин. Зменшуючи концентрацію фарбника, час фарбування можна збільшити до 10 хвилин. Плівку виймають із кювети, дають час на стікання надлишкової рідини і почергово на 5 хвилин поміщають в три кювети, які містять по 100 мл розчину для відмивання електрофореграм. Фон плівки після відмивання повинен бути білого кольору. Потім плівку промивають водою Р і сушать між листами фільтрувального паперу.
Ідентифікацію білкових фракцій препарату проводять шляхом порівняння його електрофореграми з електрофореграмою ФСЗ ДФУ розчину імуноглобуліну людини 10%, отриманої при цьому ж розділенні.
Визначення білкового складу (імуноглобуліну) проводять:
- шляхом обробки електрофореграм методом денситометрування (TotaLab v2.01, Amersham Parmacia, США, або з використанням аналогічного обладнання) або елюції його з плівки з наступним спектрофотометруванням двох паралельних нанесень:
плівку розрізають на окремі електрофореграми. Вирізають окремі фракції з препаратом, поміщають кожний відрізок у пробірку і додають 3 мл елюючого розчину. Елюцію проводять в темному місці протягом 40 хвилин при багаторазовому струшуванні. Вимірюють оптичну густину елюату на спектрофотометрі при довжині хвилі 620 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи в якості компенсаційного розчину елюат незафарбованої ділянки електрофореграми. Суму значень оптичної густини приймають за 100% і визначають який процент по відношенню до неї складає оптична густина кожної фракції.
Вміст імуноглобуліну в препараті має бути не менше 95%, вміст інших білків - не більше 5%.
Примітки:
1. Підготовка плівки. В кювету поміщають 100 мл барбіталового буферного розчину рН 8.4, потім на поверхню буферного розчину гладкою стороною кладуть плівку із ацетату целюлози, витримують протягом 2 хвилин, після чого її поміщають за допомогою пінцету на дно кювети і витримують протягом 2 хвилин. Плівку виймають пінцетом, надлишок вологи видаляють, промокнувши її поміж двох листів фільтрувального паперу. На зволоженій плівці з матової сторони формують стартові канавки.
Плівки використовують свіжоприготовані.
2. Приготування барбіталового буферного розчину рН 8.4. 8.5 г барбітал-натрію (медінал; 5.5 - диетилбарбітурат натрію) поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розводять в 600 мл води Р, додають 11 мл 1 М розчину хлористоводневої кислоти Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.
Термін придатності розчину - 3 місяці.
3. Приготування розчину бромфенолового синього. 0.05 г бромфенолового синього Р поміщають у мірну колбу місткістю 100 мл, розчиняють у 2.0 мл оцтової кислоти льодяної, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.
Термін придатності розчину 6 місяців.
4. Приготування розчину фарбника амідочорного 10 Б. 0.5 г амідочорного 10 Б (Мерк 2005-2007, К N 101167 або аналогічної якості) поміщають в колбу місткістю 250 мл, додають 10 мл кислоти оцтової льодяної Р, 3 г кислоти трихлороцтової Р, 90 мл 96% спирту Р і перемішують. Суміш залишають на 24 години, періодично струшуючи.
Термін придатності розчину - 6 місяців.
5. Приготування розчину для відмивки електрофореграм.
700 мл води Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, додають 40 мл кислоти оцтової льодяної Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.
Термін придатності розчину - 6 місяців.
6. Приготування елюючого розчину. 50 мл 0,1 М розчину натрію гідроксиду Р поміщають у колбу місткістю 100 мл, додають 5 мл 0,1 М розчину натрію едетату Р і перемішують.
Термін придатності розчину - 3 місяці.
3.9. Фракційний склад. Визначення проводять методом імуноелектрофорезу, використовуючи комерційну антисироватку проти білків сироватки крові людини.
На імунофореграмі повинна виявлятися інтенсивна дуга преципітації Ig G та не більше 4 додаткових дуг, що відповідають Ig А, Ig М, та двом іншим імунологічно неактивним фракціям.
По 2 мкл препарату поміщають в лунки пластинки з агаровим гелем. Паралельно в одну з лунок поміщають 2 мкл нормальної сироватки або плазми.
В електродні камери апарату для електрофорезу наливають барбіталовий буферний розчин рН 8.2 і поміщають пластинки з агаровим гелем. На обидва кінці пластинок поміщають смужки хроматографічного або фільтрувального паперу, розміром 120 х 60 мм, складених у 6 шарів, які з'єднують з електродними камерами. Електрофорез проводять при силі струму 10 мА, напрузі 100 В протягом 1.5 год.
Після проведення електрофорезу між лунками в агаровому гелі вирізають траншеї (10 х 2 мм), в кожну з них вносять 60 мкл видоспецифічної антисироватки, яка преципітує сироваткові білки людини (ІмБіо, Росія, або аналогічної якості) та сироватки биків, кіз, овець, коней (Імтек, Росія або аналогічної якості). Пластинку поміщають в камеру, в яку ставлять бюкс з 100 мл води Р (для зволоження) і декількома кристалами фенолу Р (консервант). Через 24 години пластинку виймають з камери, занурюють в кювету з 250 мл ізотонічного 0,9% розчину натрію хлориду Р, що містить декілька кристалів фенолу Р, і відмивають протягом 2 діб від білку, який не прийняв участі в утворенні преципітату. Розчин замінюють 4 рази на добу.
Відмиту пластинку висушують на повітрі протягом 1 год, занурюють у розчин фарбника амідочорного 10 ВР (ЕР) на 2 год. Потім пластинку виймають, дають змогу стекти фарбнику і занурюють в 2% розчин кислоти оцтової Р на 2 доби для відмивання від надлишку розчину фарбника. 2% розчин кислоти оцтової Р замінюють 4 рази на добу.
Для тесту "ідентифікація" оцінюють локалізацію і число ліній преципітації препарату відносно ліній преципітації сироватки крові людини, яка повинна проявляти не менше 15 ліній преципітації зі своєю антисироваткою. Між лунками з препаратом і антисироватками до сироваток крові тварин лінії преципітації повинні бути відсутні.
Примітки:
1. Приготування 1.25% агарового гелю. 12.5 г агару (очищеного) поміщають в хімічний стакан місткістю 1 л, додають 500 мл води Р і залишають для набухання гелю протягом 1 години при температурі від 18 до 20 град. С. Стакан поміщають на водяну баню, що кипить, і витримують до повного розчинення агару. Об'єм розчину гелю доводять водою Р до 500 мл, додають 500 мл барбіталового буферного розчину рН 8.2, перемішують, фільтрують через марлю медичну, складену в 3 шари, додають мертіолят до концентрації 100 мкг/мл і розливають у флакони по 50 мл. Перед використанням агаровий гель розплавляють на водяній бані.
Термін придатності гелю - 2 доби.
2. Приготування барбіталового буферного розчину рН 8.2. 47.6 г барбітал-натрію (медінал; 5.5 - диетилбарбітурат натрію) поміщають у колбу місткістю 5 л, додають 69 мл 1 М розчину хлористоводневої кислоти Р, 4.3 л води Р та перемішують до розчинення солей. рН розчину визначають потенціометрично (ДФУ, 1 вид. р. 2.2.3) і при необхідності коректують 1 М розчином хлористоводневої кислоти Р.
Термін придатності розчину - 3 місяці.
3. Приготування пластинок з агаровим гелем. На скляні пластинки (краще використовувати фотопластинки) розміром 120 х 90 мм наносять піпеткою 10 мл розплавленого на водяній бані при температурі від 60 до 80 град. С 1.25% агарового гелю і розтирають шпателем до отримання тонкого шару, щоб агаровий гель краще липнув до скла.
Пластинку висушують при температурі від 75 до 80 град. С протягом 5 хвилин.
Потім пластинку поміщають на горизонтальну поверхню і обережно, уникаючи утворення пухирців повітря, наливають 30 мл розплавленого при температурі від 60 до 80 град. С 1.25% агарового гелю до отримання шару товщиною 2-3 мм. Після застигання агарового гелю вирізають 7 лунок діаметром 2-3 мм, використовуючи для цього штамп.
Пластинки використовують протягом 1 доби.
4. Приготування розчину фарбника амідочорного 10 Б. 1.0 г амідочорного 10 Б (Мерк 2005-2007, К N 101167 або аналогічної якості) поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 450 мл 0,1 М розчину оцтової кислоти Р, доводять об'єм розчину 0.1 М розчином натрію ацетату Р до мітки і перемішують.
Термін зберігання розчину - 3 місяці.
5. Приготування 2% розчину кислоти оцтової Р. 300 мл води Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, додають 20 мл оцтової кислоти льодяної Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.
Термін зберігання розчину - 3 місяці.
6. Приготування ізотонічного 0.9% розчину натрію хлориду Р. 9.0 г натрію хлориду Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 500 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки, перемішують.
Термін зберігання розчину - 7 діб.
7. Приготування 0,1 М розчину натрію ацетату Р. 9.8 г натрію ацетату Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 500 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки, перемішують.
Термін зберігання розчину - 7 діб.
8. Приготування 0,1 М розчину оцтової кислоти Р. 6 г оцтової кислоти льодяної поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 500 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки, перемішують.
Термін зберігання розчину - 7 діб.
3.10. Гліцин (Глікокол). Випробування проводять методом рідинної хроматографії (ДФУ, 1 вид., р. 2.2.29).
Об'єднаний вміст від необхідної кількості ампул поміщають у мірну колбу місткістю 5.0 мл і доводять об'єм розчину до позначки. Вміст мірної колби кількісно переносять водою Р у мірну колбу місткістю 50 мл, доводять об'єм розчину до позначки водою Р і перемішують. Усі наступні операції з розчинами виконують, захищаючи їх від дії світла. 0.50 мл отриманого розчину поміщають у мірну колбу місткістю 25 мл зі скляною або фторопластовою пробкою, додають 0.05 мл розчину 2,4-динітро-1-фторбензола, 2 мл розчину натрію тетраборату, перемішують і витримують у термостаті при температурі (60 +-2.0) град. С протягом 60 хв. Розчин охолоджують до кімнатної температури, і доводять об'єм розчину рухомою фазою до позначки, перемішують (випробовуваний розчин).
По 20 мкл випробовуваного розчину і розчину порівняння поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі з УФ детектором, отримуючи не менше 3 хроматограм для кожного з розчинів, у наступних умовах:
- колонка розміром 4.6 х 125 мм, заповнена сорбентом LiChrosorb ODS з розміром часток 5 мкм (Merck) або аналогічна, для якої виконуються вимоги тесту "Перевірка придатності хроматографічної системи";
- рухома фаза: ацетонітрил Р - 0,1 М розчин натрію дигідрофосфату (з рН, доведеним до 2.5 +- 0.1) (25:75), дегазована будь-яким зручним способом;
- швидкість рухомої фази 1.0 мл/хв;
- детектування за довжини хвилі 360 нм;
- температура колонки 30 град. С.
На хроматограмі присутні наступні піки: динітрофенільне похідне гліцину - основний пік з відносним часом утримування 1.0, також можуть бути присутніми домішки реактиву (мінорні піки) з відносними часами утримування близько 1.3 і 2. При необхідності склад рухомої фази може бути відкоректованим: збільшення концентрації ацетонітрилу зменшує час утримування всіх піків; зміна концентрації натрію дигідрофосфату змінює селективність розподілу динітрофенільного похідного гліцину і домішок реактиву.
Вміст гліцину (X) у ампулі (флаконі), у грамах, обчислюють за формулою:
S х m 50 х 25 х 0.5 х 100 S х m х 20
0 0
X = --------------------------- = ------------
S х 5 х 0.5 х 50 х 25 S
0 0
де S - середнє значення площ піків динітрофенільного
похідного гліцину, обчислене з хроматограм випробовуваного
розчину;
S - середнє значення площ піків динітрофенільного похідного
0
гліцину, обчислене з хроматограм розчину порівняння;
m - маса наважки ФСЗ ДФУ гліцину, у грамах.
0
Вміст С Н NO (гліцину) в рідині імуноглобуліну повинен бути
2 5 2
від 1.5% до 3.0%.
Результати аналізу вважаються вірогідними, якщо виконуються вимоги тесту "Перевірка придатності хроматографічної системи".
Примітки:
1. Приготування розчину порівняння. Близько 0.117 г (точна наважка) ФСЗ ДФУ гліцину поміщають у мірну колбу місткістю 50 мл, розчиняють у 80 мл води Р з рН, доведеним кислотою фосфорною Р до 2.0 +- 0.1 (потенціометрично, ДФУ, 1 вид., р. 2.2.3), доводять об'єм розчину цією ж водою до позначки та перемішують. Далі поступають аналогічно випробовуваному розчину, починаючи зі слів: "0.5 мл отриманого розчину ...".
Термін придатності розчину - 2 доби.
2. Приготування розчину 2,4-динітро-1-фторбензола. 0.60 г 2,4-динітро-1-фторбензолу (Фірма "Sigma", кат. N D1529, або реактив аналогічної якості) розчиняють на водяній бані в 20 мл 2-пропанола Р.
Термін придатності розчину 2 місяці при зберіганні в захищеному від світла місці при температурі від +2 град. С до +8 град. С.
3. Приготування 0,1 М розчину натрію дигідрофосфату. 15,7 г натрію дигідрофосфату Р поміщають у мірну колбу місткістю 1000 мл, розчиняють у 200 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до позначки і перемішують. Доводять рН фосфорною кислотою Р до 2,5 +- 0,1 (потенціометрично, ДФУ, 1 вид., р.2.2.3).
Термін придатності розчину - 14 діб.
4. Приготування розчину натрію тетраборату. 3,82 г натрію тетраборату декагідрату ("Aldrich" 2004, кат. N 22,133-3) поміщають у мірну колбу місткістю 1000 мл, розчиняють у 200 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до позначки і перемішують.
Термін придатності розчину - 3 міс.
5. Приготування розчину для перевірки придатності хроматографічної системи. Всі операції з розчинами виконують, захищаючи їх від дії світла. 0.50 мл води Р з рН, доведеним кислотою фосфорною Р до 2.0 +- 0.1 (потенціометрично, ДФУ, 1 вид., р. 2.2.3) поміщають у мірну колбу місткістю 25 мл зі скляною або фторопластовою пробкою, і далі виконують операції як з випробовуваним розчином, починаючи зі слів "додають 0.05 мл розчину 2,4-динітро-1-фторбензола ...".
Термін придатності розчину - 7 діб.
6. Перевірка придатності хроматографічної системи. Для перевірки придатності хроматографічної системи хроматографують 20 мкл розчину в умовах, описаних вище. На отриманих хроматограмах повинні спостерігатися два піки з часами утримування, що перевищують таке для динітрофенільного похідного гліцину (близько 8 хв). Селективність хроматографічної системи повинна бути відрегульована таким чином, щоб на хроматограмі розчину порівняння обидва піки домішок розділялися з піком динітрофенільного похідного гліцину і мали час утримування не більше 20 хв.
Хроматографічна система вважається придатною, якщо для хроматограм розчину порівняння виконуються наступні умови (ДФУ, 1 вид., р. 2.2.29):
- ефективність хроматографічної колонки, розрахована за піком динітрофенільного похідного гліцину, повинна бути не менше 3000 теоретичних тарілок;
- ступінь розподілу піка динітрофенільного похідного гліцину з будь-якими найближчими піками повинна бути не менше 1.5;
- відносне стандартне відхилення, розраховане для площі піка динітрофенільного похідного гліцину, повинне бути не більше 1.0%;
- коефіцієнт симетрії піка, розрахований за піком динітрофенільного похідного гліцину, повинний бути не менше 0.9 і не більше 1.5.
3.11. Молекулярні параметри. Відсотковий вміст фракцій у препараті повинен бути наступний:
полімери та агрегати - не більше 10%,
мономери та димери - не менше 85% ,
У пробірку місткістю 30 мл поміщають 1 мл препарату і додають 20 мл 0.9% розчину хлориду натрію.
По 50 мкл розчинів препарату і стандарту поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі з УФ детектором, отримуючи не менше 3 хроматограм кожного з розчинів у наступних умовах:
- колонка TSKgel SW 3000xl або інша, для якої виконуються вимоги тесту "Перевірка придатності хроматографічної системи";
- рухома фаза: фосфатний буферний розчин, що містить 11.688 г хлориду натрію і 50 мг азиду натрію на 1 л, дегазована будь-яким зручним способом;
- швидкість рухомої фази - 0.5 мл/хв;
- детектування при довжині хвилі - 280 нм;
- температура колонки - +30 град. С;
На хроматограмі розчину калібрувального стандарту найбільший пік відповідає мономеру Ig G, пік з відносним часом утримання близько 0.85 відповідає димеру. Пік полімерів має відносний час утримання близько 0.70 відносно піку мономеру. Піки на хроматограмі досліджуваного розчину ідентифікують, порівнюючи їх з піками на хроматограмі розчину ФСЗ ДФУ розчину імуноглобуліну 10% для визначення високомолекулярних домішок. Відносний час утримання піків мономеру і димеру на хроматограмі досліджуваного розчину становить 1 +- 0.02 відносно піків мономеру і димеру на хроматограмі розчину стандарту, відносний час утримання піків полімерів і агрегатів на хроматограмі досліджуваного розчину становить 1 +- 0.03 відносно піків полімерів і агрегатів на хроматограмі розчину стандарту. Піки з часом утримання більшим, ніж час утримання мономеру відносять до фрагментів. Сума площ піків мономеру і димеру повинна бути не меншою 85% загальної площі всіх піків на хроматограмі, сума площ піків полімерів і агрегатів не повинна перевищувати 10% загальної площі всіх піків на хроматограмі. Результати аналізу вважаються достовірними, якщо виконуються вимоги тесту "Перевірка придатності хроматографічної смстеми".
Примітки:
1. Приготування рухомої фази. У мірній колбі місткістю 1 л зважують 4.873 г двозаміщеної натрієвої солі ортофосфорної кислоти двохводної, 1.741 г однозаміщеної натрієвої солі ортофосфорної кислоти одноводної, 11.688 г хлориду натрію і 50 мг азиду натрію. Доливають 500 мл води для ВЕРХ, обережно збовтують до повного розчинення солей і доводять водою для ВЕРХ до мітки. Розчин використовують свіжоприготованим.
2. Приготування розчину стандарту. 1 мл ФСЗ ДФУ розчину імуноглобуліну 10% для визначення високомолекулярних домішок поміщають у пробірку місткістю 30 мл і додають 20 мл 0.9% розчину хлориду натрію. Розчин використовують свіжоприготованим.
3. Перевірка придатності хроматографічної системи. Хроматографічна система вважається придатною, якщо виконуються наступні умови:
- відносне стандартне відхилення часу утримання піку мономеру, вирахуване з трьох хроматограм стандартного розчину, не перевищує 2%; ФСЗ ДФУ розчину імуноглобуліну 10% для визначення високомолекулярних домішок імуноглобуліну повинні бути чітко видимі чотири піки: димеру імуноглобуліну, мономеру імуноглобуліну, фрагментів і низькомолекулярних домішок.
3.12. Об'єм, що витягається. Препарат має відповідати вимогам ДФУ, 1 вид., р. 2.9.17.
3.13. Стерильність. Препарат має бути стерильним. Визначення проводять відповідно до вимог ДФУ, 1 вид., р. 2.6.1.
Препарат в умовах дослідження не виявляє антимікробної дії.
3.14. Пірогенність. Препарат має бути апірогенним. Тест-доза 1.5 мл препарату на 1 кг маси кроля. Вводити внутрішньовенно протягом 2 хв. Дослідження проводять відповідно вимог до медичних імунобіологічних препаратів (ДФУ, 1 вид., р. 2.6.8).
3.15. Аномальна токсичність. Тест-доза 0.5 мл препарату на 1 мишу. Вводити внутрішньочеревно протягом 5 секунд. Час спостереження 3 доби. Дослідження проводять відповідно до вимог ДФУ, 1 вид., р. 2.6.9.
3.16.Специфічна безпечність.
3.16.1. Контроль на відсутність поверхневого антигену вірусу гепатиту В.
(HBsAg). Визначення проводять імуноферментним методом використовуючи комерційні тест-системами відповідно до інструкцій по застосуванню, що до них додаються. Чутливість методу повинна бути не нижче 0.1 нг/мл.
Препарат не повинен містити поверхневого антигену вірусу гепатиту В.
13.16.2. Антитіла до вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ-1, ВІЛ-2) Визначення проводять імуноферментним методом, використовуючи комерційні тест-системи відповідно до інструкцій по застосуванню, що до них додаються. Чутливість і специфічність повинна бути 98-100%. У випадку одержання позитивного результату необхідно повторити контроль препарату в розведеннях 1:200, 1:400, 1:800. При відсутності позитивного результату в трьох послідовних розведеннях препарат вважається таким, що не містить антитіл до ВІЛ-1, ВІЛ-2 . При одержанні позитивного результату в розведеннях 1:200 та вище, імуноглобулін необхідно досліджувати методом імунного блотингу для підтвердження наявності антитіл до ВІЛ-1, ВІЛ-2. Препарат не повинен містити антитіл до ВІЛ-1, ВІЛ-2.
3.17. Кількісне визначення специфічної активності.
Антитіла до вірусу кору. У препараті повинно бути не менш 1:480 антитіл до вірусу кору в титрі (не менше 37.5 МО на 1 мл). Визначення проводять методом реакції пасивної гемаглютинації відповідно до Інструкції по застосуванню діагностикума еритроцитарного коревого сухого (ФГУ "Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера МЗ РФ" або аналогічні).
Для постановки реакції використовують планшети полістиролові з лунками об'ємом 0.200-0.225 мл зі сферичним дном. Перед постановкою реакції лунки планшета протирають вологим тампоном, змоченим ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р. В усі лунки ряду багатоканальною піпеткою вносять по 0,05 мл розчину НКС 1%. У першу лунку вносять піпеткою 0,05 мл підготовленого розчину імуноглобуліну, і тією же піпеткою, починаючи з першої лунки, препарат перемішують 5 разів та послідовно переносять в усі лунки ряду. Розведення імуноглобуліну виходить від 1:10 до 1:1280. Потім в усі лунки багатоканальною піпеткою вносять по 0.025 мл добре перемішаної 1% суспензії діагностикума коревого еритроцитарного антигенного. Планшет ретельно струшують і залишають при кімнатній температурі на 2 год до повного осідання еритроцитів у контролі (в 4 лунки планшета вносять по 0.05 мл розчину НКС 1% й 0.025 мл 1% суспензії діагностикума). Результати реакції враховують по характеру осідання еритроцитів на дні лунок:
++++ - аглютиновані еритроцити утворюють перевернену "парасольку", краї якої обпадають;
+++ - аглютиновані еритроцити утворюють перевернуту "парасольку", краї якої рівні;
++ - по краю аглютинованих еритроцитів намічається тонке кільце з неаглютинованих еритроцитів;
+ - по краю аглютинованих еритроцитів намічається широке кільце з неаглютинованих еритроцитів.
У контрольних лунках із сенсибілізованими еритроцитами в 1% розчині нормальної кролячої сироватки не повинно бути аглютинації.
Титром імуноглобуліну вважають останнє розведення, що викликає аглютинацію еритроцитів, навантажених коревим антигеном на два хрести (++). Одночасно з випробуваним імуноглобуліном необхідно титрувати ФСЗ ДФУ імуноглобулін з визначеним титром коревих антитіл. Титр коревих антитіл ФСЗ ДФУ імуноглобуліну з визначеним титром коревих антитіл повинен відповідати титру антитіл, зазначених на ампулі.
Примітки:
1. Приготування НКС 1%. У флакон із сухою сироваткою нормальною кролячою (НКС) вносять 2 мл води Р й залишають при кімнатній температурі для розчинення протягом 1 хвилини. Потім додають 18 мл ізотонічного 0.9% розчину натрію хлориду Р.
Термін придатності розчину - 1 доба при температурі зберігання від 4 град. С до 10 град. С. Сироватку, що погано розчинилася, для реакції не використовують.
2. Приготування розчину діагностикуму коревого еритроцитарного антигенного 1%.
У флакон з коревим діагностикумом вносять 2 мл води Р і залишають при кімнатній температурі на 2 год для набрякання еритроцитів. Потім додають 4 мл розчину НКС 1%.
Розчин використовують свіжоприготовленим.
3. Підготовка імуноглобуліну. Імуноглобуліни випробуваний і контрольний (ФСЗ ДФУ імуноглобулін з визначеним титром коревих антитіл) розводять 1:5 ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р до 0.1 мл імуноглобуліну додають 0.4 мл ізотонічного 0.9% розчину натрію хлориду Р.
Антиальфастафилолізин.
1 мл препарату повинен містити не менш 5 МО антиальфастафілолізина. Визначення проводять за допомогою реакції нейтралізації гемолітичних властивостей стафілококового альфатоксина.
Готують розведення імуноглобуліну за наступною схемою:
------------------------------------------------------------------
| |Передбачу-| Розведення | Отримання необхідних розведень |
| | вана | препарату |------------------------------------|
| |кількість | | Кількість | ізотонічний |
| | МО/мл | | досліджуваного | 0.9% розчин |
| | | | препарату (мл) |натрію хлориду|
| | | | | Р (мл) |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
| 1.|0.2 |нерозведений| |_ |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
| 2.|0.5 |1 : 2.5 |0.5 |1.5 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
| 3.|1 |1 : 5 |1.0 |4.0 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
| 4.|2 |1 : 10 |1.0 |9.0 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
| 5.|3 |1 : 15 |1.0 |1.0 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
| 6.|4 |1 : 20 |0.5 із пробірки N 3 |1.5 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
| 7.|5 |1 : 25 |0.5 із пробірки N 3 |2.0 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
| 8.|6 |1 : 30 |0.5 із пробірки N 3 |2.5 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
| 9.|7 |1 : 35 |0.5 із пробірки N 3 |3.0 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
|10.|8 |1 : 40 |0.5 із пробірки N 3 |3.5 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
|11.|9 |1 : 45 |0.5 із пробірки N 3 |4.0 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
|12.|10 |1 : 50 |0.5 із пробірки N 3 |4.5 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
|13.|14 |1 : 70 |0.5 із пробірки N 4 |3.0 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
|14.|16 |1 : 80 |0.5 із пробірки N 4 |3.5 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
|15.|18 |1 : 90 |0.5 із пробірки N 4 |4.0 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
|16.|20 |1 : 100 |0.5 із пробірки N 4 |4.5 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
|17.|22 |1 : 110 |0.5 із пробірки N 4 |5.0 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
|18.|24 |1 : 120 |0.5 із пробірки N 4 |5.5 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
|19.|26 |1 : 130 |0.5 із пробірки N 4 |6.0 |
|---+----------+------------+---------------------+--------------|
|20.|28 |1 : 140 |0.5 із пробірки N 4 |6.5 |
------------------------------------------------------------------
У кожну пробірку додають по 0.5 мл робочого стафілококового альфатоксина, струшують круговими рухами, потім додають по 1 краплі (0.05 мл) 15% робочої суспензії еритроцитів кролика, струшують і витримують у термостаті при температурі 37 град. С 1 год. Після витримки в термостаті пробірки відразу ж охолоджують при температурі від 4 град. С до 6 град. С, потім центрифугують при 1500 об/хв протягом 5 хв.
Визначають оптичну густину надосадової рідини на фотоелектроколориметрі, при довжині хвилі 400 нм у кюветах з товщиною шару 1 мм, розчином порівняння служить ізотонічний 0.9% розчин натрію хлориду Р. Оптична густина, що відповідає 50% гемолізу еритроцитів - 0.3-0.4.
Одночасно для підтвердження точності робочої дози токсину, що використовується в дослідженні, титрують контрольний ряд з деякими ФСЗ ДФУ антиальфастафилолізин.
ФСЗ ДФУ антиальфастафилолізин розводять до вмісту 1 МО в 1 мл, потім із цього розведення готують наступні розведення за схемою:
------------------------------------------------------------------
| N | ФСЗ ДФУ |Ізотонічний 0.9%| Концентрація |
| про-|антиальфастафілолізин в| розчин натрію | розчину ФСЗ ДФУ |
|бірки|розведенні 1 МО/мл (мл)| хлориду Р (мл) |антиальфастафіло-|
| | | | лізина |
|-----+-----------------------+----------------+-----------------|
|1. | 1.0 | 3.17 | 0.12 |
|-----+-----------------------+----------------+-----------------|
|2. | 1.0 | 3.55 | 0.11 |
|-----+-----------------------+----------------+-----------------|
|3. | 1.0 | 4.0 | 0.10 |
|-----+-----------------------+----------------+-----------------|
|4. | 1.0 | 4.56 | 0.09 |
|-----+-----------------------+----------------+-----------------|
|5. | 1.0 | 5.25 | 0.08 |
------------------------------------------------------------------
Процедура титрування й обліку результатів контрольного ряду аналогічна титруванню досліджуваного препарату. Отримані дані титрування ФСЗ ДФУ антиальфастафілолізина необхідні для визначення коефіцієнта перерахування по формулі:
К = а/0,1;
де К - коефіцієнт перерахування;
а - концентрація ФСЗ ДФУ антиальфастафилолізина в першій пробірці контрольного ряду з оптичною густиною 0.3-0.4. Коефіцієнт перерахування визначають для кожного конкретного досліду.
Вміст антиальфастафілолізина (X) в 1 мл препарату розраховують по формулі:
X = 0.2 МО х К х Р,
де 0.2 МО - вміст антиальфастафілолізина в 1 мл ФСЗ ДФУ антиальфастафілолізина;
К - коефіцієнт перерахування;
Р - величина розведення випробуваного імуноглобуліну в першій пробірці дослідного ряду з показником оптичної густини 0.3-0.4.
Примітки:
1. Приготування 15% робочої суспензії еритроцитів кролика. Кров кролика беруть із краєвих вен вуха в ємність зі скляним намистом і струшують протягом 10-15 хв. Дефібриновану кров кролика фільтрують, додають 3-5 кратний об'єм ізотонічного 0.9% розчину натрію хлориду Р, перемішують і центрифугують при 1500 об/хв протягом 15 хв. Процедуру повторюють три рази, одержують відмиті еритроцити кролика. До 1.5 мл відмитих еритроцитів кролика додають 8.5 мл ізотонічного 0.9% розчину натрію хлориду Р. Потім 0.5 мл підготовленої суспензії гемолізують в 2 мл води Р. Вимірюють оптичну густину розчину, отриманого в результаті гемолізу на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 400 нм у кюветі з товщиною шару 1 мм. Розчином порівняння служить вода Р. Оптична густина повинна бути в межах від 0.52 до 0.54. У випадку невідповідності оптичної густини, 15% робочу суспензію еритроцитів коригують ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р.
Термін придатності 15% робочої суспензії - 1 доба.
2. Визначення активності гемолитічної дії стафілококового альфатоксина. Виходячи з активності токсину, зазначеного в паспорті, у ряд пробірок наливають відповідну кількість токсину з інтервалом в 0.01 мл. Наприклад: Lh токсину становить 0.14 мл. У дослід беруть 7 пробірок, у які наливають стафілококовий токсин у наступних кількостях: 0.11; 0.12; 0.13; 0.14; 0.15; 0.16; 0.17. Потім доводять об'єм кожної пробірки ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р до 1 мл і додають у кожну пробірку по 1 мл ФСЗ ДФУ антиальфастафилолізина, що містить 1 МО/мл. Пробірки обережно струшують, витримують при кімнатній температурі 15 хв. Потім у кожну пробірку додають по 0.1 мл робочої суспензії еритроцитів. Пробірки знову струшують і витримують у термостаті при температурі 37 град. С протягом 1 години. Одночасно готують контрольні пробірки: у першу пробірку беруть 1 мл робочого розчину стафілококового токсину, 1 мл розчину натрію хлориду 0.9%, дві краплі робочої суспензії еритроцитів (100% гемоліз). У другу пробірку беруть 2 мл розчину натрію хлориду 0.9%, дві краплі робочої суспензії еритроцитів (відсутність гемолізу). Результати враховують візуально за схемою:
++++ - повний гемоліз еритроцитів;
+++ - майже повний гемоліз еритроцитів;
++ - 50% гемоліз еритроцитів;
- - - - відсутність гемолізу еритроцитів.
Кількість токсину, що міститься в першій пробірці, де пройшов майже повний гемоліз (+++), приймається за активність гемолітичної дії стафілококового альфатоксина.
3. Приготування робочого розчину стафілококового альфатоксина. Стафілококовий альфатоксин з точно встановленою величиною активності безпосередньо перед використанням у досліді розводять ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р, одержуючи розчин токсину, що містить Lh/5 в 1 мл. Загальний об'єм робочого розчину стафілококового токсину і кількість вихідного (цільного) токсину, необхідного для постановки кожного конкретного досліду, розраховують, виходячи з величини Lh/5 в 1 мл і кількості пробірок, які будуть використані в досліді. Правильність розрахункової кількості токсину підтверджують постановкою розгорнутого контролю з ФСЗ ДФУ антиальфастафілолізина.
Додаткова характеристика препарату. Речовини, що входять до складу препарату:
Натрію хлорид (ДФУ 1 вид, доповнення 1) для створення ізотонічності розчину.
Пакування. По 1.5 мл або 3.0 мл в ампулах у відповідності до вимог ДФУ, вид. 1, доповнення 1, р. 3.2.1. По 10 ампул разом з інструкцією по застосуванню та ножем для розкриття ампул за ТУ У 64-00.481198.008-98 чи скарифікатором ампульним за ТУ У 143120045.002-98 вкладають у коробку з перегородками або гофрованою вкладкою за ОСТ 64-071-89 або за ТУ 42-14-2-81 з картону для споживчої тари марки А за ГОСТ 7933-89 або картону хрому-ерзацу за ТУ 13-02-81020-97-90.
На етикетці групової тари додатково вказують кількість пакувань.
Групова та транспортна тара відповідно до ГОСТ 17768-90.
Маркування. На ампулу наносять назву препарату українською чи російською мовою, концентрацію, об'єм препарату в мл, номер серії, термін придатності.
На пачці українською або українською та російською мовою вказують: найменування підприємства-виробника, його товарний знак та адресу, назву препарату латинською та українською або латинською та російською мовами, концентрацію, об'єм препарату в мл, кількість ампул, "Стерильно", "Внутрішньом'язово", умови зберігання, "Зберігати в недоступному для дітей місці", номер серії, реєстраційний номер, термін придатності, штриховий код, "Антитіла до ВІЛ відсутні".
Номер серії та термін придатності препарату дозволяється наносити на бічній стороні пачки методом тиснення.
На етикетці групової тари додатково вказують кількість пакувань.
Зберігання. В сухому, захищеному від світла місці при температурі від +2 до +8 град. С .
Термін придатності. За результатами вивчення стабільності.
Засіб для профілактики вірусного гепатиту А, кору, кашлюку, менінгококової інфекції, поліомієліту, лікування гіпо- і агамаглобулінемій, для підвищення імунного статусу в період реконвалесценції при деяких інфекційних і неінфекційних захворюваннях.
Примітка. Реактиви, титровані розчини та індикатори, приведені в цій АНД, описані у відповідних розділах ДФУ видання 1, доповнення 1.
Перший заступник Голови Державної служби лікарських
засобів і виробів медичного призначення I.Б.Демченко
Затверджено
Наказ Міністерства охорони
здоров'я України
02.06.2005 N 247
Державний Герб України
Медичні імунобіологічні препарати
Настанова з якості
Керівництво по складанню аналітично-нормативної
документації на імуноглобулін людини антирезус
Rh0 (D) рідкий
(Immunoglobulinum humanym antirhesus Rh0 (D) fluidum)
Настанова 42-3002-004-2005
Київ
Міністерство охорони здоров'я України
2005
Зміст
1. Сфера застосування та основні вимоги
2. Специфікація
3. Методи контролю
3.1. Специфічна активність
1. Сфера застосування та основні вимоги
Це керівництво по складанню аналітично-нормативної документації поширюється на медичний імунобіологічний препарат Імуноглобулін людини антирезус Rh0 (D), рідкий, що містить імуноглобуліни, переважно імуноглобулін G (IgG). Препарат призначений для внутрішньом'язевого введення. Його отримують з плазми крові D - негативних донорів, імунізованих D - антигеном. Препарат містить специфічні антитіла (анти-Rh0 (D) до еритроцитарного D - антигену та незначну кількість антитіл до груп крові.
Імуноглобулін людини антирезус Rh0 (D) отримують з плазми, яка відповідає вимогам нормативного документу "Плазма людини для фракціонування", та містить неповні антитіла анти-Rh0 (D) з титром не нижче 1:64, та антитіла анти-rh' (С) не вище 1:16.
При виготовленні препарату виробничі пули плазми повинні перевірятися методом полімеразної ланцюгової реакції на вміст нуклеїнових кислот вірусу гепатиту С, вірусу гепатиту В, парвовірусу В-19, ВІЛ 1 та 2.
Імуноглобулінову фракцію білків сироватки або плазми крові донорів виділяють, очищують і концентрують методом фракціонування спиртоводними осаджувачами при температурі нижче 0 град. С.
Препарат відповідає аналітично-нормативній документації на імуноглобулін людини нормальний, рідкий, за винятком кількості донорів, вмісту загального білка та специфічної активності.
Препарат не містить консерванту і антибіотиків. імуноглобулін людини антирезус Rh0 (D) виробляється як стабілізований розчин - в розчині 9 г/л розчину хлориду натрію, 22,5 г/л розчину гліцину. Розчин імуноглобуліну фільтрують в асептичних умовах через стерилізуючий фільтр з діаметром пор не більше 0,22 мкм.
При виробництві рідкий препарат повинен витримувати тест прискоренної деградації: при витримуванні зразків кінцевого препарату при 37 град. С чотири тижні, втрата специфічної активності не повинна перевищувати 20% від початкової.
Випускають в рідкому стані. Титр антитіл анти-Rh0 (D) в дозі становить не менше 1:2000, що визначається за допомогою непрямої проби Кумбса.
Засіб для профілактики та запобігання резус сенсибілізації (утворення анти-Rh0 (D) антитіл) у резус-негативних жінок, які народили Rh0 (D) позитивних дітей або жінок, які перенесли штучне переривання вагітності при Rh0 (D) - позитивній належності крові чоловіка.
2. Специфікація
Специфікація
------------------------------------------------------------------
| Найменування | Встановлене значення | Метод контролю |
|показників контролю | | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
| 1 | 2 | 3 |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Опис |Відповідає вимогам до |За АНД на |
|Автентичність |імуноглобуліну людини |імуноглобулін |
|(ідентифікація) |нормального |людини нормальний |
|Прозорість | | |
|Кольоровість | | |
|Механічні включення | | |
|рН | | |
|Склад білків. | | |
|Електрофоретична | | |
|однорідність | | |
|Фракційний склад | | |
|Молекулярні | | |
|параметри | | |
|Об'єм, що | | |
|витягається | | |
|Стерильність | | |
|Пірогенність | | |
|Аномальна | | |
|токсичність | | |
|Специфічна | | |
|безпечність | | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Специфічна |В 1 дозі препарату титр|За п. 3.1, Непряма |
|активність |антитіл анти-Rh (D) |проба Кумбса |
| | 0 | |
| |повинен становити не | |
| |менше 1:2000. | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Маркування |Відповідає вимогам до | |
| |імуноглобуліну людини | |
| |нормального із | |
| |зазначенням специфічної| |
| |активності. | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Термін придатності |За результатами | |
| |дослідження | |
| |стабільності. | |
------------------------------------------------------------------
3. Методи контролю
3.1. Специфічна активність
Специфічна активність. Специфічна активність препарату визначається за вмістом антитіл анти-Rh0 (D). Вміст антитіл анти-Rh0 (D) визначають непрямою пробою Кумбса. Препарат вважають активним, якщо титр антитіл анти-Rh0 (D) у ньому становить не менше 1:2000 в 1 мл, при випуску препарату по 1 мл (1 доза), та 1:1000 в мл, при випуску препарату по 2 мл (1 доза).
У штатив встановлюють чотири горизонтальних ряди по 15 пробірок з круглим дном, об'ємом 2-10 мл.
У першу та другу пробірку кожного ряду вносять пастерівською піпеткою по 2 краплі досліджуваного препарату, потім у всі пробірки, починаючи з другої, додають 2 краплі 0.9% розчину натрію хлориду Р.
Із пробірки N 2 кожного ряду після перемішування її вмісту за допомогою піпетки, переносять 2 краплі в пробірку N 3 і т. д. до останньої пробірки, із якої, після перемішування, 2 краплі виливають. Після чого, у всі пробірки додають по 2 краплі 10% розчину желатини. У результаті у всіх пробірках виявляється: в першій кожного ряду - цілий препарат - імуноглобулін антирезус, а в наступних - розведений від 1:2 до 1:16 000.
У всі пробірки додають 1 краплю суміші еритроцитів групи 0 (I) різних по резус належності: в перший ряд - еритроцити фенотипу Rh0 (cDe); в другий - rh' (Cde), в третій rh'' (cdE), повністю відмитих тричі. Весь штатив з пробірками ставлять у водяну баню при температурі 46-48 град. С на 10 хвилин. Через 10 хв штатив витягують і у всі пробірки додають по три-п'ять крапель 0.9% розчину натрію хлориду Р, та перемішують трьох кратним переворотом пробірок.
Із кожної пробірки, де візуально не видно аглютинації, береться крапля суміші на предметне скло, кінчиком піпетки розподіляється по склу до утворення тонкого шару і спостерігається під мікроскопом при малому збільшенні, об'єктив "х10", на наявність аглютинів. Останнє розведення, в якому спостерігається аглютинація, приймається за титр цих антитіл.
Якщо аглютинація еритроцитів спостерігається у всіх розведеннях, то, відповідно, титр резус-антитіл вищий, ніж отримане розведення. У такому випадку слід повторити титрування, приготувавши ще більші розведення досліджуваного препарату.
Паралельно в четвертому ряді ставиться контроль на відсутність специфічності. До 2 крапель готового препарату додають 2 краплі 10% розчину желатини та 1 краплю еритроцитів групи 0 (I) rh (-) негативного фенотипу rh (cde). Ця проба повинна бути завжди негативною.
У тих випадках, коли в готовому препараті містяться антитіла анти-Rh0 (D) з титром 1:512-1:1024, він розливається в ампули по 2 мл; якщо титр анти-Rh0 (D) 1:2000 і вище, препарат розливають по 1 мл. У препараті допускається наявність антитіл анти- rh' (Cde) з титром до 1:256 і анти-rh'' (cdE) до 1:32.
Примітка. Приготування 0.9% розчину натрію хлориду Р. 9.0 г натрію хлориду Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 500 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки, перемішують.
Термін зберігання розчину 7 діб.
Перший заступник Голови Державної служби лікарських
засобів і виробів медичного призначення I.Б.Демченко
Затверджено
Наказ Міністерства охорони
здоров'я України
02.06.2005 N 247
Державний Герб України
Медичні імунобіологічні препарати
Настанова з якості
Керівництво по складанню аналітично-нормативної
документації на імуноглобулін людини
антистафілококовий, рідкий)
(Immunoglobulinum humanum antistaphlococcum
fluidum)
Настанова 42-3002-005-2005
Київ
Міністерство охорони здоров'я України
2005
Зміст
1. Сфера застосування та основні вимоги
2. Специфікація
3. Методи контролю
3.1. Специфічна активність
1. Сфера застосування та основні вимоги
Це керівництво по складанню аналітично-нормативної документації поширюється на медичний імунобіологічний препарат Імуноглобулін людини антистафілококовий, рідкий, що містить імуноглобуліни, переважно імуноглобулін G (IgG). Препарат призначений для внутрішньом'язевого введення. Імуноглобулін людини антистафілококовий отримують з плазми крові донорів, що містить антитіла до стафілококового екзотоксину.
Імуноглобулін людини антистафілококовий рідкий отримують з плазми, яка відповідає вимогам нормативного документу "Плазма людини для фракціонування".
При виготовленні препарату виробничі пули плазми повинні перевірятися методом полімеразної ланцюгової реакції на вміст нуклеїнових кислот вірусу гепатиту С, вірусу гепатиту В, парвовірусу В-19, ВІЛ 1 та 2.
Імуноглобулінову фракцію білків сироватки або плазми крові донорів виділяють, очищують і концентрують методом фракціонування спиртоводними осаджувачами при температурі нижче 0 град. С.
Препарат відповідає аналітично-нормативній документації на імуноглобулін людини нормальний, рідкий, за винятком кількості донорів, вмісту загального білка та специфічної активності.
Препарат не містить консерванту і антибіотиків та виробляється як стабілізований розчин - в розчині 9 г/л розчину хлориду натрію, 22.5 г/л розчину гліцину. Розчин імуноглобуліну фільтрують в асептичних умовах через стерилізуючий фільтр з діаметром пор, не більше 0.22 мкм.
Випускають в рідкому стані. 1 мл препарату повинен містити не менше 20 МО антиальфастафілолізину. Засіб для лікування хворих та профілактики ускладнень, викликаних стафілококовою інфекцією.
2. Специфікація
Специфікація
------------------------------------------------------------------
| Найменування | Встановлене значення | Метод контролю |
|показників контролю | | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
| 1 | 2 | 3 |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Опис |Відповідає вимогам до |За АНД на |
|Автентичність |імуноглобуліну людини |імуноглобулін |
|(ідентифікація) |нормального |людини нормальний |
|Прозорість | | |
|Кольоровість | | |
|Механічні включення | | |
|рН | | |
|Склад білків. | | |
|Електрофоретична | | |
|однорідність | | |
|Фракційний склад | | |
|Молекулярні | | |
|параметри | | |
|Об'єм, що | | |
|витягається | | |
|Стерильність | | |
|Пірогенність | | |
|Аномальна | | |
|токсичність | | |
|Специфічна | | |
|безпечність | | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Специфічна |В 1 мл препарату |За реакцією |
|активність |повинно міститися не |нейтралізації |
| |менше 20 МО |гемолітичних |
| |антиальфастафілолізина.|властивостей |
| | |стафілококового |
| | |альфатоксина. |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Маркування |Відповідає вимогам до | |
| |імуноглобуліну людини | |
| |нормального, із | |
| |зазначенням специфічної| |
| |активності. | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Термін придатності |За результатами | |
| |дослідження | |
| |стабільності. | |
------------------------------------------------------------------
3. Методи контролю
3.1 Специфічна активність. Специфічна активність препарату визначається за вмістом антиальфастафілолізина.
1 мл препарату повинен містити не менш 20 МО антиальфастафілолізина. Визначення проводять за допомогою реакції нейтралізації гемолітичних властивостей стафілококового альфатоксина.
Готують розведення імуноглобуліну за наступною схемою:
------------------------------------------------------------------
| N |Ізотонічний|Імуноглобулін|Розведення|Передбачу-|Примітка |
| про- |0.9% розчин| (мл) | | вана | |
|бірки | натрію | | |кількість | |
| | хлориду Р | | | МО/мл в | |
| | (мл) | | |препараті | |
|------+-----------+-------------+----------+----------+---------|
| 1. | 1.2 |0.3 | 1:5 | 1 | |
|------+-----------+-------------+----------+----------+---------|
| 2. | 1.0 |з першої 1.0 | 1:10 | 2 | |
|------+-----------+-------------+----------+----------+---------|
| 3. | 0.25 |із другої 0.5| 1:15 | 3 | |
|------+-----------+-------------+----------+----------+---------|
| 4. | 0.5 |із другої 0.5| 1:20 | 4 | |
|------+-----------+-------------+----------+----------+---------|
| 5. | 0.75 |із другої 0.5| 1:25 | 5 | |
|------+-----------+-------------+----------+----------+---------|
| 6. | 0.25 |із третьої | 1:30 | 6 | |
| | |0.25 | | | |
|------+-----------+-------------+----------+----------+---------|
| 7. | 0.5 |із четвертої | 1:40 | 8 |забрати |
| | |0.5 | | |0.5 мл |
|------+-----------+-------------+----------+----------+---------|
| 8. | 2.0 |із другої 0.5| 1:50 | 10 |забрати |
| | | | | |2.0 мл |
|------+-----------+-------------+----------+----------+---------|
| 9. | | | | | |
|------+-----------+-------------+----------+----------+---------|
| 10. | | | | | |
------------------------------------------------------------------
У кожну пробірку додають по 0.5 мл робочого стафілококового альфатоксина, струшують круговими рухами, потім додають по 1 краплі (0,05 мл) 15% робочої суспензії еритроцитів кролика, струшують і витримують у термостаті при температурі 37 град. С 1 год. Після витримки в термостаті, пробірки відразу ж охолоджують при температурі від 4 град. С до 6 град. С, потім центрифугують при 1500 об/хв протягом 5 хв.
Визначають оптичну густину надосадової рідини на фотоелектроколориметрі, при довжині хвилі 400 нм у кюветах з товщиною шару 1 мм, розчином порівняння служить ізотонічний 0.9% розчин натрію хлориду Р. Оптична густина, що відповідає 50% гемолізу еритроцитів - 0.3-0.4.
Одночасно для підтвердження точності робочої дози токсину, що використовується в дослідженні, титрують контрольний ряд з деякими ФСЗ ДФУ антиальфастафилолізин.
ФСЗ ДФУ антиальфастафилолізин розводять до вмісту 1 МО в 1 мл, потім із цього розведення готують наступні розведення за схемою:
------------------------------------------------------------------
| N | ФСЗ ДФУ |Ізотонічний 0.9%| Концентрація |
| про-|альфастафілолізина| розчин натрію | розчину ФСЗ ДФУ |
|бірки| в розведенні | хлориду Р (мл) |антиальфастафілолізина|
| | 1 МО/мл (мл) | | |
|-----+------------------+----------------+----------------------|
|1. | 1.0 | 3.17 | 0.12 |
|-----+------------------+----------------+----------------------|
|2. | 1.0 | 3.55 | 0.11 |
|-----+------------------+----------------+----------------------|
|3. | 1.0 | 4.0 | 0.10 |
|-----+------------------+----------------+----------------------|
|4. | 1.0 | 4.56 | 0.09 |
|-----+------------------+----------------+----------------------|
|5. | 1.0 | 5.25 | 0.08 |
------------------------------------------------------------------
Процедура титрування й обліку результатів контрольного ряду аналогічна титруванню досліджуваного препарату. Отримані дані титрування ФСЗ ДФУ антиальфастафілолізина необхідні для визначення коефіцієнта перерахування по формулі:
К = а / 0,1;
де К - коефіцієнт перерахування;
а - концентрація ФСЗ ДФУ антиальфастафилолізина в першій пробірці контрольного ряду з оптичною густиною 0.3-0.4. Коефіцієнт перерахування визначають для кожного конкретного досліду.
Вміст антиальфастафілолізина (X) в 1 мл препарату розраховують по формулі:
X = 0.2 МО х К х Р,
де 0.2 МО - вміст антиальфастафілолізина в 1 мл ФСЗ ДФУ антиальфастафілолізина;
К - коефіцієнт перерахування;
Р - величина розведення випробуваного імуноглобуліну в першій пробірці дослідного ряду з показником оптичної густини 0.3-0.4.
Примітка. 1 Приготування 15% робочої суспензії еритроцитів кролика.
Кров кролика беруть із краєвих вен вуха в ємність зі скляним намистом і струшують протягом 10-15 хв. Дефібриновану кров кролика фільтрують, додають 3-5 кратний об'єм ізотонічного 0.9% розчину натрію хлориду Р, перемішують і центрифугують при 1500 об/хв протягом 15 хв. Процедуру повторюють три рази, одержують відмиті еритроцити кролика. До 1.5 мл відмитих еритроцитів кролика додають 8.5 мл ізотонічного 0.9% розчину натрію хлориду Р. Потім 0.5 мл підготовленої суспензії гемолізують у 2 мл води Р. Вимірюють оптичну густину розчину, отриманого в результаті гемолізу на фотоелектроколориметрі, при довжині хвилі 400 нм у кюветі з товщиною шару 1 мм. Розчином порівняння служить вода Р. Оптична густина повинна бути в межах від 0.52 до 0.54. У випадку невідповідності оптичної густини, 15% робочу суспензію еритроцитів коригують ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р.
Термін придатності 15% робочої суспензії - 1 доба.
2. Визначення активності гемолитічної дії стафілококового альфатоксина. Виходячи з активності токсину, зазначеного в паспорті, у ряд пробірок наливають відповідну кількість токсину з інтервалом в 0.01 мл. Наприклад: Lh токсину становить 0.14 мл. У дослід беруть 7 пробірок, у які наливають стафілококовий токсин у наступних кількостях: 0.11; 0.12; 0.13; 0.14; 0.15; 0.16; 0.17. Потім доводять об'єм кожної пробірки ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р до 1 мл і додають у кожну пробірку по 1 мл ФСЗ ДФУ антиальфастафилолізина, що містить 1 МО/мл. Пробірки обережно струшують, витримують при кімнатній температурі 15 хв. Потім у кожну пробірку додають по 0.1 мл робочої суспензії еритроцитів. Пробірки знову струшують і витримують у термостаті при температурі 37 град. С протягом 1 години. Одночасно готують контрольні пробірки: у першу пробірку беруть 1 мл робочого розчину стафілококового токсину, 1 мл розчину натрію хлориду 0.9%, дві краплі робочої суспензії еритроцитів (100% гемоліз). У другу пробірку беруть 2 мл розчину натрію хлориду 0.9%, дві краплі робочої суспензії еритроцитів (відсутність гемолізу). Результати враховують візуально за схемою:
++++ - повний гемоліз еритроцитів;
+++ - майже повний гемоліз еритроцитів;
++ - 50% гемоліз еритроцитів;
- - - - відсутність гемолізу еритроцитів.
Кількість токсину, що міститься в першій пробірці, де пройшов майже повний гемоліз (+++), приймається за активність гемолітичної дії стафілококового альфатоксина.
3. Приготування робочого розчину стафілококового альфатоксина.
Стафілококовий альфатоксин, з точно встановленою величиною активності, безпосередньо перед використанням у досліді розводять ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р, одержуючи розчин токсину, що містить Lh/5 в 1 мл. Загальний об'єм робочого розчину стафілококового токсину і кількість вихідного (цільного) токсину, необхідного для постановки кожного конкретного досліду, розраховують, виходячи з величини Lh/5 в 1 мл і кількості пробірок, які будуть використані в досліді. Правильність розрахункової кількості токсину підтверджують постановкою розгорнутого контролю з ФСЗ ДФУ антиальфастафілолізина.
Перший заступник Голови Державної служби лікарських
засобів і виробів медичного призначення I.Б.Демченко
Затверджено
Наказ Міністерства охорони
здоров'я України
02.06.2005 N 247
Державний Герб України
Медичні імунобіологічні препарати
Настанова з якості
Керівництво по складанню аналітично-нормативної
документації на імуноглобулін людини
проти краснухи, рідкий
(Immunoglobulinum humanum rubeollae fluidum)
Настанова 42-3002-006-2005
Київ
Міністерство охорони здоров'я України
2005
Зміст
1. Сфера застосування та основні вимоги
2. Специфікація
3. Методи контролю
3.1. Специфічна активність
1. Сфера застосування та основні вимоги
Це керівництво по складанню аналітично-нормативної документації поширюється на медичний імунобіологічний препарат Імуноглобулін людини проти краснухи, рідкий, що містить імуноглобуліни, переважно імуноглобулін G (Ig G). Препарат призначений для внутрішньом'язевого введення. Його отримують з плазми крові, що містить антитіла до вірусу краснухи. Може додаватися імуноглобулін людини нормальний.
Імуноглобулін людини рідкий проти краснухи отримують з плазми, яка відповідає вимогам нормативного документу "Плазма людини для фракціонування".
При виготовленні препарату виробничі пули плазми повинні перевірятися методом полімеразної ланцюгової реакції на вміст нуклеїнових кислот вірусу гепатиту С, вірусу гепатиту В, парвовірусу В-19, ВІЛ 1 та 2.
Імуноглобулінову фракцію білків сироватки або плазми крові донорів виділяють, очищують і концентрують методом фракціонування спиртоводними осаджувачами при температурі нижче 0 град. С.
Препарат відповідає аналітично-нормативній документації на імуноглобулін людини нормальний, рідкий, за винятком кількості донорів, вмісту загального білка та специфічної активності.
Препарат не містить консерванту і антибіотиків та виробляється як стабілізований розчин - в розчині 9 г/л розчину хлориду натрію, 22.5 г/л розчину гліцину. Розчин імуноглобуліну фільтрують в асептичних умовах через стерилізуючий фільтр з діаметром пор, не більше 0.22 мкм.
1 мл препарату повинен містити не менше 2250 МО антитіл проти вірусу краснухи.
2. Специфікація
Специфікація
------------------------------------------------------------------
| Найменування | Встановлене значення | Метод контролю |
|показників контролю | | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
| 1 | 2 | 3 |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Опис |Відповідає вимогам до |За АНД на |
|Автентичність |імуноглобуліну людини |імуноглобулін |
|(ідентифікація) |нормального |людини нормальний |
|Прозорість | | |
|Кольоровість | | |
|Механічні включення | | |
|рН | | |
|Склад білків. | | |
|Електрофоретична | | |
|однорідність | | |
|Фракційний склад | | |
|Молекулярні | | |
|параметри | | |
|Об'єм, що | | |
|витягається | | |
|Стерильність | | |
|Пірогенність | | |
|Аномальна | | |
|токсичність | | |
|Специфічна | | |
|безпечність | | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Специфічна |Активність повинна |За п. 3.1 |
|активність |складати від 2250 до | |
| |9000 МО/мл. | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Маркування |Відповідає вимогам до | |
| |імуноглобуліну людини | |
| |нормального із | |
| |зазначенням специфічної| |
| |активності. | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Термін придатності |За результатами | |
| |дослідження | |
| |стабільності. | |
------------------------------------------------------------------
3. Методи контролю
3.1. Специфічна активність
Специфічну активність визначають шляхом порівняння активності досліджуваного імуноглобуліну, тестом гемаглютинації пригніченої з активністю препарату порівняння, каліброваного в міжнародних одиницях (МО), або іншим валідованим методом.
Міжнародна одиниця - це активність, що міститься у зазначеному об'ємі міжнародного стандарту імуноглобуліну проти краснухи. Еквівалентність в Міжнародних одиницях Міжнародного стандарту вказана ВООЗ.
Визначена активність складає не менше 4500 МО/мл. Довірчий інтервал (Р = 0,95) визначеної активності повинен бути не менше, ніж 50%, і не більше, ніж 200% зазначеної активності.
Перший заступник Голови Державної служби лікарських
засобів і виробів медичного призначення I.Б.Демченко
Затверджено
Наказ Міністерства охорони
здоров'я України
02.06.2005 N 247
Державний Герб України
Медичні імунобіологічні препарати
Настанова з якості
Керівництво по складанню аналітично-нормативної
документації на імуноглобулін людини
проти гепатиту В, рідкий
Настанова 42-3002-007-2005
Київ
Міністерство охорони здоров'я України
2005
Зміст
1. Сфера застосування та основні вимоги
2. Специфікація
3. Методи контролю
3.1. Специфічна активность
1. Сфера застосування та основні вимоги
Це керівництво по складанню аналітично-нормативної документації поширюється на медичний імунобіологічний препарат Імуноглобулін людини проти гепатиту В, рідкий, що містить імуноглобуліни, переважно імуноглобулін G (IgG). Препарат призначений для внутрішньом'язевого введення. Його отримують з плазми крові відібраних та/або імунізованих донорів, що містять антитіла до поверхневого антигену гепатиту В. Може додаватися імуноглобулін людини нормальний.
Імуноглобулін людини проти гепатиту В отримують з плазми, яка відповідає вимогам нормативного документу "Плазма людини для фракціонування".
При виготовленні препарату виробничі пули плазми повинні перевірятися методом полімеразної ланцюгової реакції на вміст нуклеїнових кислот вірусу гепатиту С, вірусу гепатиту В, парвовірусу В-19, ВІЛ 1 та 2.
Імуноглобулінову фракцію білків сироватки або плазми крові донорів виділяють, очищують і концентрують методом фракціонування спиртоводними осадниками при температурі нижче 0 град. С.
Препарат відповідає аналітично-нормативній документації на імуноглобулін людини нормальний, рідкий, за винятком кількості донорів, вмісту загального білка та специфічної активності.
Препарат не містить консерванту і антибіотиків та виробляється як стабілізований розчин - в розчині 9 г/л розчину хлориду натрію, 22.5 г/л розчину гліцину. Розчин імуноглобуліну фільтрують в асептичних умовах через стерилізуючий фільтр з діаметром пор, не більше 0.22 мкм.
1 мл препарату повинен містити не менше 125 МО антитіл проти вірусу гепатиту В.
2. Специфікація
Специфікація
------------------------------------------------------------------
| Найменування | Встановлене значення | Метод контролю |
|показників контролю | | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
| 1 | 2 | 3 |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Опис |Відповідає вимогам до |За АНД на |
|Автентичність |імуноглобуліну людини |імуноглобулін |
|(ідентифікація) |нормального |людини нормальний |
|Прозорість | | |
|Кольоровість | | |
|Механічні включення | | |
|рН | | |
|Склад білків. | | |
|Електрофоретична | | |
|однорідність | | |
|Фракційний склад | | |
|Молекулярні | | |
|параметри | | |
|Об'єм, що | | |
|витягається | | |
|Стерильність | | |
|Пірогенність | | |
|Аномальна | | |
|токсичність | | |
|Специфічна | | |
|безпечність | | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Специфічна |Активність препарату |За п. 3.1 |
|активність |повинна складати від 80| |
| |до 125 МО. | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Маркування |Відповідає вимогам до | |
| |імуноглобуліну людини | |
| |нормального із | |
| |зазначенням специфічної| |
| |активності. | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Термін придатності |За результатами | |
| |дослідження | |
| |стабільності. | |
------------------------------------------------------------------
3. Методи контролю
3.1. Специфічна активність
Специфічну активність визначають шляхом порівняння титру антитіл досліджуваного імуноглобуліну з титром препарату порівняння, каліброваного в міжнародних одиницях (МО), з використанням методу імуноферментного аналізу, з використанням комерційних тест-систем, що мають відповідну чутливість та специфічність.
Міжнародна одиниця - це активність, що міститься у зазначеному об'ємі міжнародного препарату порівняння імуноглобуліну проти гепатиту В. Еквівалентність в Міжнародних одиницях Міжнародного препарату порівняння вказана ВООЗ.
Зазначена активність складає не менше 100 МО/мл. Визначена активність препарату повинна бути не меншою, ніж зазначена. Довірчий інтервал (Р = 0,95) визначеної активності повинен бути в межах від 80 до 125%.
Перший заступник Голови Державної служби лікарських
засобів і виробів медичного призначення I.Б.Демченко
Затверджено
Наказ Міністерства охорони
здоров'я України
02.06.2005 N 247
Державний Герб України
Медичні імунобіологічні препарати
Настанова з якості
Керівництво по складанню аналітично-нормативної
документації на Імуноглобулін людини
проти вітряної віспи, рідкий
(Immunoglobulinum humanum varicellae fluidum)
Настанова 42-3002-008-2005
Київ
Міністерство охорони здоров'я України
2005
Зміст
1. Сфера застосування та основні вимоги
2. Специфікація
3. Методи контролю
3.1. Специфічна активність
1. Сфера застосування та основні вимоги
Це керівництво по складанню аналітично-нормативної документації поширюється на медичний імунобіологічний препарат Імуноглобулін людини проти вітряної віспи, рідкий, що містить імуноглобуліни, переважно імуноглобулін G (Ig G). Препарат призначений для внутрішньом'язевого введення. Його отримують з плазми крові відібраних донорів, що мають антитіла до вірусу вітряно віспи (Herpesvirus varicellae). Може додаватися імуноглобулін людини нормальний.
Імуноглобулін людини проти вітряної віспи отримують з плазми, яка відповідає вимогам нормативного документу "Плазма людини для фракціонування".
При виготовленні препарату виробничі пули плазми повинні перевірятися методом полімеразної ланцюгової реакції на вміст нуклеїнових кислот вірусу гепатиту С, вірусу гепатиту В, парвовірусу В-19, ВІЛ 1 та 2.
Імуноглобулінову фракцію білків сироватки або плазми крові донорів виділяють, очищують і концентрують методом фракціонування спиртоводними осаджувачами при температурі нижче 0 град. С.
Препарат відповідає аналітично-нормативній документації на імуноглобулін людини нормальний, рідкий, за винятком кількості донорів, вмісту загального білка та специфічної активності.
Препарат не містить консерванту і антибіотиків та виробляється як стабілізований розчин - в розчині 9 г/л розчину хлориду натрію, 22.5 г/л розчину гліцину. Розчин імуноглобуліну фільтрують в асептичних умовах через стерилізуючий фільтр з діаметром пор, не більше 0.22 мкм.
1 мл препарату повинен містити не менше 80 МО антитіл проти збудника вітряної віспи.
2. Специфікація
Специфікація
------------------------------------------------------------------
| Найменування | Встановлене значення | Метод контролю |
|показників контролю | | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
| 1 | 2 | 3 |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Опис |Відповідає вимогам до |За АНД на |
|Автентичність |імуноглобуліну людини |імуноглобулін |
|(ідентифікація) |нормального |людини нормальний |
|Прозорість | | |
|Кольоровість | | |
|Механічні включення | | |
|рН | | |
|Склад білків. | | |
|Електрофоретична | | |
|однорідність | | |
|Фракційний склад | | |
|Молекулярні | | |
|параметри | | |
|Об'єм, що | | |
|витягається | | |
|Стерильність | | |
|Пірогенність | | |
|Аномальна | | |
|токсичність | | |
|Специфічна | | |
|безпечність | | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Специфічна |Активність препарату |За п. 3.1 |
|активність |повинна складати від 80| |
| |до 125 МО/мл. | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Маркування |Відповідає вимогам до | |
| |імуноглобуліну людини | |
| |нормального із | |
| |зазначенням специфічної| |
| |активності. | |
|--------------------+-----------------------+-------------------|
|Термін придатності |За результатами | |
| |дослідження | |
| |стабільності. | |
------------------------------------------------------------------
3. Методи контролю
3.1. Специфічна активність
Специфічну активність визначають шляхом порівняння титру антитіл досліджуваного імуноглобуліну з титром антитіл препарату порівняння, каліброваного в міжнародних одиницях (МО), з використанням методу імуноферментного аналізу, з використанням комерційних тест-систем, що мають відповідну чутливість та специфічність.
Міжнародна одиниця - це активність, що міститься у зазначеному об'ємі міжнародного стандарту проти висипної віспи (varicela-zoster). Еквівалентність в Міжнародних одиницях Міжнародного стандарту вказана ВООЗ.
Зазначена активність складає не менше 100 МО/мл. Визначена активність препарату повинна бути не меншою, ніж зазначена. Довірчий інтервал (Р = 0,95) визначеної активності повинен бути в межах від 80 до 125%.
Перший заступник Голови Державної служби лікарських
засобів і виробів медичного призначення I.Б.Демченко